維生素B12 的發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用

□宋曉偉 黃 勛

一、維生素B12 簡介

維生素B12 又名鈷胺素，簡稱VB12，為紅色晶體，是自然界唯一含有金屬元素的維生素，也是目前已知的分子量最大，結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的維生素。VB12 是1926 年由美國哈佛醫(yī)學(xué)院Minot 和Murphy 首先發(fā)現(xiàn)并用于“阿的生貧血病”的治療［1］，而Minot 等人也因此獲得了1934 年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。1948 年，英美兩國科學(xué)家?guī)缀跬瑫r從肝臟中提取得到了這種紅色的晶體［2～3］，并命名為維生素B12。1955 年英國牛津大學(xué)的Hodgkin 則第一次確定了VB12 的化學(xué)結(jié)構(gòu)［4］，如圖1所示。中心咕啉環(huán)、中心環(huán)軸向Coβ 配基部分及1 個含有核苷酸環(huán)的Coα 配基。中心咕啉環(huán)由相連的4 個吡咯和1 個鈷原子組成，鈷螯合在4 個吡咯中心。1972 年美國科學(xué)家Woodward，R.B 所領(lǐng)導(dǎo)的團隊，歷時11 年，首次完成了VB12的全化學(xué)合成［5］。

圖1 維生素B12 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

現(xiàn)在，全球VB12 總產(chǎn)能達106 噸，總需求量在44噸，國際為主要需求市場，年需求量在40 噸左右，主要應(yīng)用于營養(yǎng)補充劑領(lǐng)域，國內(nèi)需求在4 噸，主要應(yīng)用于藥物和飼料添加劑領(lǐng)域。氰鈷胺占到市場份額的82%，衍生物10%，添加劑8%。國內(nèi)市場藥典版本需求量在450～500 公斤/年，添加劑在3，000～3，550 公斤/年。由于目前中國出口仍然停留在以VB12 原粉為主，低端添加劑為輔的階段，尚無能力與國外公司(DSM)新的產(chǎn)品劑型競爭，需大力開拓高端市場。

二、維生素B12 的生物合成

由于維生素B12 化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它是自然界中生物合成途徑最為復(fù)雜的小分子生物物質(zhì)之一，隨著科技的發(fā)展，維生素B12 的生物合成途徑也已有了詳細的研究和闡述。但是，因為合成步驟多，不易完成，到目前為止，還未有產(chǎn)業(yè)化的報道。維生素B12 主要由真細菌和部分古生菌通過生物厭氧和耗氧途徑合成，生物合成過程涉及的基因有30 余個［6］。Escalante－ Semerena、Warren、Scott、Blanche、Battersby 等人通過對脫單假單胞菌屬(Pseudomonas denitrificans)耗氧合成VB12 的研究，闡述了VB12 的耗氧合成途徑［6～11］。而厭氧合成途徑涉及菌種主要有費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)［12］、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)［13］、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)［14］。

三、發(fā)酵法生產(chǎn)維生素B12

由于VB12 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成過程繁瑣而且成本昂貴。最初是通過從動物肝臟等組織中提取，但效率低下。后來從鏈霉素發(fā)酵廢液中提取，但是產(chǎn)能級效率依舊十分有限。直到20 世紀(jì)70 年代，開始專門的微生物商業(yè)化生產(chǎn)，全球VB12 的產(chǎn)能才逐步提高。

表1 生產(chǎn)VB12 的各種細菌及其產(chǎn)率

(一)菌株。自然界中可以產(chǎn)VB12 的只有微生物，但不是所有微生物都可合成維生素B12，只有相當(dāng)一部分原核生物可以通過生物途徑合成維生素B12。可用于生產(chǎn)維生素B12 的菌株的產(chǎn)率如表1 所示［15］。應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株主要有厭氧費氏丙酸桿菌(P.freudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(P.shermanii)及耗氧的脫單假單孢桿菌(P.denitrificans)。通過厭氧發(fā)酵生產(chǎn)維生素B12 的產(chǎn)率較低，國內(nèi)各生產(chǎn)企業(yè)主要進行好氧發(fā)酵。當(dāng)前，國內(nèi)耗氧微生物發(fā)酵法生產(chǎn)維生素B12 的發(fā)酵水平在200～260 mg/L，好的批次發(fā)酵水平已接近300mg/L。

(二)工藝。

1.好氧發(fā)酵工藝。好氧發(fā)酵的菌株主要是脫單假單胞菌(P.denitrificans)，培養(yǎng)基以甜菜糖蜜、麥芽糖、蔗糖為碳源，以玉米漿及酵母膏為氮源，添加無機鹽及Co，并添加5，6－ 二甲基苯并咪唑及甜菜堿作為前體。張嗣良團隊對過程參數(shù)控制及發(fā)酵放大過程進行了優(yōu)化［16］，在工業(yè)生產(chǎn)中除帝斯曼在歐洲保留了一條耗氧生產(chǎn)線以外，國內(nèi)的華北制藥集團，石藥集團，玉峰藥業(yè)，寧夏多維等也多采用好氧發(fā)酵生產(chǎn)VB12。采用120m3的標(biāo)準(zhǔn)好氧發(fā)酵罐，一般采用流加碳源的分批補料三級發(fā)酵工藝。最適發(fā)酵溫度為32℃，最適PH 值為7.0 ±0.5，發(fā)酵過程流加甜菜堿及前體，并控制發(fā)酵過程發(fā)酵液中甜菜堿的含量在0.1%～1.0%，發(fā)酵周期在160h～180h。該工藝發(fā)酵水平數(shù)倍于厭氧發(fā)酵，在生產(chǎn)氰鈷胺時有巨大優(yōu)勢。

2.厭氧發(fā)酵工藝。厭氧發(fā)酵工藝采用的菌種有氧費氏丙酸桿菌(P.freudenreichii)、謝氏丙酸桿菌(P.shermanii)。丙酸桿菌降解葡萄糖產(chǎn)生丙酸、乙酸的伍德－ 沃克曼反應(yīng)途徑中涉及到甲基丙二酰CoA 異構(gòu)酶，該酶需要VB12 作為輔酶，所以丙酸桿菌中存在著生物合成VB12 的全套遺傳物質(zhì)及完整合成途徑。

工業(yè)生產(chǎn)過程中，只有石藥集團還保留有厭氧VB12 發(fā)酵生產(chǎn)線，以謝氏丙酸桿菌(P.shermanii)為生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)基主要以葡萄糖為碳源，玉米漿為氮源，添加無機鹽及Co 源，并添加前體5，6－ 二甲基苯并咪唑，最適溫度控制在30℃，最適PH 用氨水控制在6.5，低速間歇攪拌，發(fā)酵周期為90h 左右。由于厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物80%以上為腺苷鈷胺，雖產(chǎn)能較低，但是在生產(chǎn)腺苷鈷胺時有明顯優(yōu)勢，而且產(chǎn)品雜質(zhì)少、易分離，還可從發(fā)酵液中提取丙酸等副產(chǎn)品。

四、維生素B12 的應(yīng)用

(一)醫(yī)療應(yīng)用。維生素B12 在醫(yī)療方面的應(yīng)用主要是針對VB12 缺乏癥的治療和預(yù)防。維生素B12 缺乏將導(dǎo)致DNA 的合成減少，有絲分裂速率降低，延遲甚至破壞正常細胞特別是骨髓細胞和粘膜細胞的分化，形成不正常的巨細胞，從而形成巨幼紅細胞性貧血。因此，維生素B12 可輔助治療巨幼紅細胞性貧血、藥物中毒引起的貧血、再生障礙性貧血和白細胞減少癥等［17～18］。維生素B12 還有維護神經(jīng)髓鞘的代謝與功能，因此維生素B12 作為一些神經(jīng)方面疾病或損傷的輔助治療藥物。最近研究顯示，維生素B12 的缺乏與抑郁癥［19］及老年癡呆等精神疾病也有一定的聯(lián)系，維生素B12 亦可用于抑郁癥的輔助治療，及老年癡呆的預(yù)防。

(二)飼料應(yīng)用。維生素B12 可以促進動物對蛋白質(zhì)的利用和個體的生長，特別是幼小動物。對于常見人工飼養(yǎng)的牲畜及禽類，只有反芻類動物自身可通過生物途徑合成維生素B12。因此對于非反芻類哺乳動物，在禽類等飼料中添加維生素B12 有重要意義。對于魚類的養(yǎng)殖，維生素B12 有助于魚類抵抗水體中重金屬及相關(guān)有毒成分的能力，降低魚苗的死亡率。對于全世界來說，瘋牛病事件以后也逐步使用成分明確的營養(yǎng)品替代原有的骨肉粉。盡管維生素B12 可用于很多方面的醫(yī)學(xué)治療，但目前世界上維生素B12 的最大消費途徑，還是飼料添加劑。

(三)其他應(yīng)用。除了醫(yī)療及飼料的用途VB12 還在一些工業(yè)及視屏領(lǐng)域用著重要用途，例如食品著色、室內(nèi)環(huán)保去除甲醛、自然環(huán)境中鹵素脫鹵等。

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