坐骨神經損傷端端吻合術后配合川穹嗪注射液治療的實驗研究

羅 偉，周云龍，孫振毅，馬堅妹

（1山東省龍口市中醫院，山東龍口265701；2大連醫科大學，遼寧大連116000）

坐骨神經損傷端端吻合術后配合川穹嗪注射液治療的實驗研究

羅 偉1，周云龍2，孫振毅2，馬堅妹2

（1山東省龍口市中醫院，山東龍口265701；2大連醫科大學，遼寧大連116000）

目的：探討坐骨神經損傷端端吻合術后配合川穹嗪注射液治療的實驗效果．方法：選取健康SD大鼠12只，制備大鼠左側坐骨神經切斷后端端吻合模型．實驗動物隨機分為兩組，每組6只，給藥組：腹腔注射川穹嗪注射液，0．3 mg／d，共4周；對照組注射同體積的生理鹽水．術后第1～4周分別進行行為學分析及坐骨神經功能指數（SFI）測定，術后第4周檢測小腿三頭肌濕重，并進一步截取吻合近側段和遠側段的坐骨神經，利用免疫組化MBP髓鞘染色方法，采用Image J軟件對吻合近側段和遠側段陽性信號灰度值進行比較分析，以觀察神經再生情況．結果：第4周末，給藥組有部分個體足跡變短，對照組仍有個別自噬發生，兩組SFI評分比較具有顯著性差異（P＜0．05）；術后4周給藥組小腿三頭肌殘存率明顯高于對照組，具有顯著性差異（P＜0．05）；給藥組和對照組吻合口遠側段和近側段MBP信號灰度值的比值比較無顯著差異（P＞0．05）．結論：川穹嗪注射液對周圍神經損傷端端吻合術后恢復具有一定的促進作用．

坐骨神經損傷；端端吻合術；川穹嗪注射液

0 引言

周圍神經損傷是常見的創傷并發癥，具有病程長、對患者健康損害大、治療困難等特點．周圍神經損傷后常用的手術方式有端端吻合、端側吻合、神經移植等，端端吻合術為周圍神經損傷修復的金標準．中醫藥在治療周圍神經損傷方面也取得了一定的成績，川穹嗪注射液可以抗血小板凝聚和解聚已凝集的血小板，抗凝血，抗血酸形成及溶解血栓，擴張小動脈和增加心肌收縮率［1］．另外，川芎嗪可以降低血液粘稠度，減少血漿纖維蛋白原，改善血液高凝狀態，增加心腦腎等重要器官的血流量作用［2］．本研究利用大鼠制作單側坐骨神經切斷端端吻合術模型，對比分析川穹嗪治療組和對照組行為學恢復過程、坐骨神經評分、小腿三頭肌濕重和軸突再生情況，探討川穹嗪在促進外周神經損傷后再生中的作用．

1 材料和方法

1．1 實驗儀器 CM3050冰凍切片機（德國LEI- CA）；Nikon 80i圖像分析儀（日本Nikon）；BT-100B數顯恒流泵（上海青浦西儀器廠）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；PHS-3C型數字式pH計（上海精密科學儀器有限公司）；MS-3 basic漩渦混合器（德國IKA）；RCT basic磁力加熱攪拌器（德國IKA）；LX-100手掌型離心機（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；SIM-F140AY65型制冰機（日本SANYO）；電熱恒溫干燥箱、SHZ-C型水浴恒溫振蕩器（上海躍進醫療器械廠）；通風柜（寧美加力有限公司）；MINI MR型攪拌器（德國IKA）．

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗動物及分組 健康成年Sprague-Dawley大鼠，性別隨機，體質量200～220 g（由大連醫科大學實驗動物中心提供），共12只，大鼠稱重后隨機分配為兩組：給藥組：單側坐骨神經切斷行端端吻合術后使用川穹嗪治療；對照組：單側坐骨神經切斷行端端吻合術后使用等量生理鹽水腹腔內．手術均在左側后肢進行，右側后肢作為健康空白對照．

1．2．2 手術步驟 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯臥位，常規備皮、消毒、固定四肢．取左側股后斜切口，切開皮膚，于肌肉深面用小號眼科剪沿肌肉方向鈍性分離暴露左側坐骨神經，在10倍顯微鏡下于坐骨神經距梨狀肌下緣1 cm處用顯微剪剪斷坐骨神經，以神經表面營養血管為解剖標志對位，即刻采用9-0無創尼龍縫合線外膜縫合4針，盡可能地保證斷端對合整齊、縫線打結松緊度一致．在神經吻合處周圍組織縫合一針，保留縫合線作為吻合處標記，以備二次取用坐骨神經，縫合傷口．術后肢體不固定．術后大鼠給予保暖直至麻醉蘇醒．以上手術操作均在無菌條件下進行，大鼠均未給予抗生素治療．

1．2．3 給藥方法和劑量 給藥組自術后第1日起，根據大鼠體重與人體比例，每天腹腔注射以2 mL蒸餾水稀釋的鹽酸川穹嗪約0．3 mg，每日上午一次，術后連續給藥4周；對照組使用生理鹽水替代．

1．3 觀察指標

1．3．1 行為學分析

1．3．1．1 大體觀察情況 于術后每日給藥時觀察大鼠傷口愈合情況，下肢活動情況，肢體末端有無破潰，傷側足的自噬情況，對刺激的反應情況．

1．3．1．2 坐骨神經功能指數（SFI）測定 所有動物的坐骨神經功能指數在術后7、14、21、28 d進行測定．坐骨神經功能指數SFI＝0為正常，-100為完全損傷，測量足跡給藥組與對照組同一天進行，每次每只大鼠測量6次，選取最清晰3次足跡作為統計資料．傷側以爪背拖行者及足跡無法辨認者，SFI記為-100．

1．3．2 小腿三頭肌濕重 大鼠給藥4周后，水合氯醛過量麻醉處死大鼠．手術切開皮膚、去除皮下組織，顯露兩側小腿三頭肌全長，自肌肉近側切開，完整剝離雙側坐骨神經，于腱止點處完整取下小腿三頭肌，立即用電子天平測定肌濕重、記錄．用手術側肌肉濕重與正常側肌肉濕重之比表示肌肉殘存率，即殘存率＝術側腓腸肌濕重／正常側腓腸肌濕重×100%．給藥組與對照組同一天進行取材，肌肉切取后稱重3次，取3次平均值作為數據記錄．

1．3．3 神經再生 體式顯微鏡下將大鼠左側坐骨神經從周圍組織中分離，僅保留神經外膜，以手術所留縫合線頭為標志確定坐骨神經吻合口，分別在距吻合部位的近側和遠側端各1．0 cm處切取坐骨神經，切取段約長5 mm，每段神經標記近側和遠側端，將大鼠皮膚做縫合后統一收集銷毀．取上述兩段坐骨神經干，于4%多聚甲醛溶液中后固定過夜，20%DEPC蔗糖水內置換過夜后，OCT包埋，神經組織采用連續冰凍矢狀切片，片厚16 μm，每段神經選取3張近中間部分的完整切片用于免疫組織化學染色．免疫組化染色在切片中間部位選取3個40倍視野拍照，利用免疫組化MBP髓鞘染色方法，采用ImageJ軟件對吻合近側段和遠側段陽性信號灰度值行進比較分析，以觀察神經再生情況．

1．4 統計學處理 應用SPSS11．5軟件進行統計分析，結果用±s表示，采用配對比較的t檢驗，P＜0．05作為統計結果有顯著性意義的判定標準．

2 結果

2．1 行為學分析

2．1．1 一般觀察 大鼠手術后第1日即出現顯著的坐骨神經功能喪失的表現，可見受損側腳印明顯變長，受損側后腿完全麻痹而用后爪背行走的拖行步態．自第3日發現大鼠出現左足自噬情況．術后1、2、3周，手術側足趾、足跟出現紅腫、潰瘍等失神經表現，給藥組與對照組基本相同．自第4周開始，給藥組大鼠自噬及潰瘍情況有所減輕，活動增加，足印變短，給藥組已無自噬情況，對照組仍有個別自噬發生．

2．1．2 坐骨神經功能指數（SFI） 在術后第1、2、3周末有明顯的坐骨神經功能喪失表現，因大鼠患足無法足掌觸地行走致傷足足印無法測出，故給藥組和對照組SFI分數均為-100，兩組無差異．第4周末，給藥組有部分個體足跡變短，SFI評分為（-44．4± 16．3）分，對照組仍有個別自噬發生，說明動物感覺功能尚未恢復，SFI評分為（-99．9±8．1）分．經統計學分析兩組間比較具有顯著性差異（P＜0．05）．

2．2 小腿三頭肌濕重 術后4周給藥組小腿三頭肌殘存率為（0．72±0．03）%，鹽水對照組為（0．67± 0．05）%，兩組間具有顯著性差異（P＜0．05）．

2．3 神經纖維恢復情況 術后4周，對吻合口近側和遠側段坐骨神經行MBP免疫組化髓鞘染色．結果可見，無論是對照組還是給藥組，其近側段髓鞘均均勻一致，染色致密（圖1A和1B）．而在遠側段，對照組僅見少量MBP陽性信號（圖1D），給藥組（圖1C）雖然MBP信號較比近側段稀疏，但是優于對照組（圖1D）．為了解成功再生并通過吻合口的神經纖維數量，我們進一步將給藥組和對照組吻合口遠側段和近側段MBP信號灰度值的比值進行了比較，結果顯示給藥組為（0．97±0．02），對照組為（0．96±0．01）．給藥組優于對照組，但無顯著性差異（P＞0．05）．

圖1 免疫組化染色大鼠坐骨神經髓鞘丟失情況

3 討論

周圍神經損傷是臨床上比較常見的創傷并發癥，雖然有多種藥物及物理治療方法，但術后神經再生速度仍舊緩慢．除手術吻合外尋找新的藥物治療方法，有效提高神經再生速度，對周圍神經損傷的臨床治療具有極其重要的意義［3］．目前結合神經吻合術后使用的臨床藥物有西藥、中藥和中藥復方等［4］．中藥提取物作為一種新的研究方向，異軍突起，具有效果確切、價格低廉、臨床易推廣等特點［5］．

川穹在中醫中被稱為血中之氣藥，具有活血行氣、消散淤血、祛風止痛之功效［6］，其主要活性成分為川穹嗪，已有研究表明，川穹嗪具有活血化瘀，抗血小板凝集，擴張小動脈，改善微循環，抗氧化，拮抗鈣離子及抗纖維化等作用［7］．川穹嗪作用機制比較復雜，目前在臨床上主要應用于治療和預防各種血管性疾病，效果較好［8］．近年來，關于川穹嗪在神經系統的損傷保護尤其是缺血／再灌注損傷中的保護作用及其機制逐漸成為熱點問題而被廣泛研究．研究表明，川穹嗪對神經系統缺血損傷保護治療的作用機制主要集中以下幾個方面：①改善腦血流；②抗氧化作用；③抗炎作用；④抗神經元凋亡作用［9-10］．

本研究發現川穹嗪注射液對周圍神經損傷端端吻合術后再生有一定的促進作用．由于坐骨神經完全切斷端端吻合后的恢復相對緩慢，并且模型所做吻合為神經外膜吻合，即對包裹在神經最外面的疏松結締組織進行縫合，并沒有進行神經束膜的吻合，因此恢復較慢，表現在最初的術后3周內，無論是對照組還是給藥組SFI均為-100．術后4周開始，從行為學分析來看，給藥組大鼠開始恢復，已無自噬，并且潰瘍情況也有所減輕，活動增加，足印變短，而對照組仍有個別自噬發生，說明其感覺功能尚未恢復．從小腿三頭肌殘存率來看，術后4周給藥組與對照組比具有顯著性差異，說明在術后4周，給藥組肌肉的萎縮程度小于對照組．根據以上結果，川穹嗪的作用似乎并不是直接作用于神經再生，而是通過保護軸突，增強雪旺細胞活性，促進吻合口周圍組織的血運，改善微循環，保護運動終板、緩解感覺終器的退變和肌肉萎縮起作用．從髓鞘免疫組化染色數據分析來看，給藥組與對照組無統計學差異，這一結果也在一定程度上印證了我們的猜測．以上結果表明，川穹嗪注射液對周圍神經損傷端端吻合術后功能恢復具有一定的促進作用，其作用可能是通過促進血管內皮的修復，擴張小動脈，改善局部的微循環來實現的．

綜上所述，川穹嗪注射液對周圍神經損傷端端吻合術后恢復具有一定的促進作用．

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2095-6894（2015）05-006-03

2015-03-22；接受日期：2015-04-08

羅 偉．碩士，主治醫師．Tel：0535-8549708 E-mail：lwszwk＠163．com