匙羹藤總皂苷抗氧化活性研究

吳華慧 李 姝 潘柳谷 黃燕軍

（廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

匙羹藤總皂苷抗氧化活性研究

吳華慧 李 姝 潘柳谷 黃燕軍

（廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021）

目的：研究匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、和脂質過氧化物（LPO）作用的影響。方法：通過硫代巴比妥酸（TBA）分光光度法測定大鼠肝臟脂質過氧化(LPO)的二級分解產物丙二醛(MDA)的含量，以考察匙羹藤總皂苷對實驗大鼠肝臟LPO的作用影響，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，鉬酸銨顯色法測定CAT的活力，考察匙羹藤總皂苷對實驗大鼠肝臟SOD和CAT的作用大小。結果：與對照組比較匙羹藤總皂苷在1.0mg/ml～6.0mg/ml濃度范圍可抑制大鼠肝臟LPO作用；在1.0mg/ml～6.5mg/ml濃度范圍內可提高大鼠肝臟SOD和CAT的活性。結論：匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟SOD和CAT的活性，降低MDA的產生。

超氧化物歧化酶（SOD）；過氧化氫酶（CAT）；脂質過氧化物（LPO）；匙羹藤

抗衰老生物學和自由基生物學是近年來生命科學的研究熱點，研究和開發新型抗氧化功能食品和天然抗氧化劑能滿足人們對健康長壽日益增長的要求，根據衰老的自由基理論，研究抗衰老植物的報告頗多，其研究途徑大致有三大類：一是，研究抗衰老植物有無直接清除自由基的作用；二是，研究抗衰老植物能否提高機體內抗氧化酶的活性，以達到間接清除自由基的目的；三是，研究抗衰老植物是否具有抑制脂質過氧化物及代謝廢物的作用。本實驗研究的匙羹藤總皂苷，在國內外的報道大多是對小鼠細胞的某些免疫學效應、藥理作用及臨床應用上的研究[1-3]，而對其抗氧化活性的生物化學研究方法少見報道。本研究匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟線粒體LPO作用的影響，以及對大鼠肝臟線粒體SOD、CAT 活性的影響。筆者采用大鼠肝臟組織勻漿進行實驗測定的方法，了解匙羹藤總皂苷對實驗大鼠肝臟SOD、CAT、LPO作用的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和主要儀器

FJ-200高速分散勻質機（上海標本模型廠）；3k15臺式高速冷凍離心機（SIGM公司）；數顯式三用電熱恒溫水溫箱；電子天平；722型分光光度計；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒、蛋白定量測試盒(上述測試盒均為南京建成生物工程研究所制)、硫代巴比妥酸；冰醋酸；L—半胱氨酸；2-硫代巴比妥酸（TBA）；1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TEP）；SD大鼠,體重180-220g（雌性各半），由廣西醫科大學實驗動物中心提供(動物生產許可證SCSK桂2014-0003)；試驗用水為自制雙蒸水。

1.2方法

1.2.1肝勻漿的制備

①勻漿介質的制備：將 Tris1.21g及 EDTA-2Na37.23mg加雙蒸水500ml,再用200mmol/LHCL進行滴定至pH7.4,然后加入3.42g蔗糖，8gNaCL,用雙蒸水稀釋到1000 ml，放入鹽水瓶中，以9磅壓力進行消毒30min，4℃冰箱中備用。

②取SD(體重180g～220g)大鼠，禁食一天，頸椎脫臼處死，取肝臟，立即用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，剪刀剪碎，用預冷的勻漿介質稀釋成 20%肝勻漿，高速分散勻質機勻漿，之后置高速冷凝離心機中3000r/min離心15min，取上清液，用含糖PBS稀釋配制成10%肝勻漿。用考馬斯亮藍法測定其蛋白含量[4]。

1.2.2匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟LPO的影響

在1.0mL的4g/L肝反應液中依次加入0.05mL硫酸亞鐵、0.02mL L-半胱氨酸、不同濃度的匙羹藤總皂苷樣品，混勻，37℃水浴 15min,再加入 2.0mL醋酸終止反應，最后加入2.0mLTBA，混勻，沸水中加熱15min，流水冷卻，在532nm處測吸光度值。

1.2.3匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟SOD的影響

采用試劑盒黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

表1　SOD活力測定操作表

混勻，室溫靜置10min，1cm光徑，雙蒸水調零，550nm處測吸光度值。

組織勻漿中SOD活力計算公式：

SOD活力（U/mgprot）=（對照OD值-測定OD值）∕對照 OD值÷50%×稀釋倍數÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)

1.2.4匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟CAT的影響

采用試劑盒鉬酸銨顯色法測定CAT的活力。

表2　CAT活力測定操作表

混勻，0.5cm光徑，405nm處，雙蒸水調零，測吸光度值。

組織勻漿中CAT活力計算公式：

CAT活力（U/mgprot）=（對照OD值-測定OD值）×271 ×（1/60×取樣量）÷待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)

1.2.5數據處理

采用統計學軟件SPSS13.0進行分析，結果以均數±標準差（±s）表示。組間分析采用One-Way ANOVA和SNK-q兩兩比較得到相應P值。以P<0.05或P<0.01差異顯著，有統計學意義。

2 結果與討論

2.1不同劑量匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟LPO影響

結果由表3可見，除雌性大鼠樣品組7和雄性大鼠樣品組5與對照組比較無顯著性差異外，其余各組肝臟LPO值均低于對照組(P<0.05)。說明匙羹藤總皂苷在 1.0mg/ml～6.0mg/ml濃度范圍可以抑制大鼠肝臟脂質過氧化。

表3　總皂苷對大鼠肝臟LPO的影響（n=4，±s）

表3　總皂苷對大鼠肝臟LPO的影響（n=4，±s）

注：樣品組與對照組比較，經t檢驗，除*組的P>0.05外，其余各組P＜0.05。

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對照組　0 .00 　2.230±0.01　2.905±0.01 LPO含量(umol/g.蛋白) 　抑制率(%)樣品組1 　1.00 　1.945±0.02　2.519±0.02 　12.78 　13.29 2 　2.00 　1.955±0.03　2.596±0.01 　12.33 　10.64 3 　3.00 　1.900±0.01　2.110±0.03 　14.80 　27.37 4 　4.00 　1.756±0.03　2.098±0.04 　21.26 　27.78 5 　4.50 　1.652±0.06　2.084±0.08 　25.92 　28.26*6 　5.50 　1.632±0.05　1.986±0.00 　26.82 　31.64 7 　6.00 　1.643±0.02　1.985±0.02 　26.32*　31.67

2.2不同劑量匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟SOD的影響

結果見表4，匙羹藤總皂苷加入量在1.00～6.50mg之間，與對照組比較SOD活性明顯提高，說明匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟線粒體SOD的活性。

表4　總皂苷對大鼠肝臟SOD活性的影響（n=4，±s）

表4　總皂苷對大鼠肝臟SOD活性的影響（n=4，±s）

注：與對照組比較經t經驗，樣品組各點p<0.05

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對照組　0 　2.43±0.01 　3.57±0.01 SOD活力（U/mgprot） 　提高率(%)樣品組1 　1.00 　2.89±0.03 　3.83±0.01 　18.93 　7.28 2 　2.00 　2.88±0.07 　3.81±0.13 　18.52 　6.72 3 　3.00 　2.91±0.06 　3.96±0.21 　19.75 　10.92 4 　4.00 　2.91±0.02 　4.05±0.26 　19.75 　13.45 5 　5.00 　3.15±0.20 　4.29±0.20 　29.63 　20.17 6 　5.50 　3.22±0.08 　4.89±0.11 　32.51 　36.97 7 　6.00 　3.46±0.01 　4.98±0.01 　42.39 　39.50 8 　6.50 　3.43±0.07 　5.08±0.02 　41.15 　42.30

2.3不同劑量匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟CAT的影響

結果見表5，匙羹藤總皂苷加入量在之間，與對照組比較CAT活性明顯提高，說明匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟線粒體CAT的活性。

表5　總皂苷對大鼠肝臟CAT活性的影響（n=4，±s）

表5　總皂苷對大鼠肝臟CAT活性的影響（n=4，±s）

注：與對照組比較經t經驗，樣品組各點p<0.05

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對照組　0 　10.21±0.01　10.59±0.01 CAT活力（U/mgprot） 　提高率(%)樣品組1 　1.00 　10.82±0.03　11.02±0.01 　5.97 　4.06 2 　2.00 　11.06±0.07　11.89±0.13 　8.33 　12.27 3 　3.00 　12.19±0.06　12.02±0.21 　19.39 　13.50 4 　4.00 　12.35±0.02　12.56±0.26 　20.96 　18.60 5 　4.50 　13.25±0.20　12.94±0.20 　29.77 　22.19 6 　5.50 　13.78±0.08　13.59±0.11 　34.97 　28.33 7 　6.00 　14.20±0.01　13.97±0.01 　39.08 　31.92 8 　6.50 　14.58±0.07　14.28±0.02 　42.80 　34.84

2.4討論

研究大鼠肝臟LPO、SOD、CAT已經有一套較成熟的實驗方法，通過加入匙羹藤總皂苷對大鼠肝臟線粒體作用模型的影響，用細胞勻漿硫代巴比妥酸(Thiobarituric acid, TBA)比色，測定大鼠肝臟線粒體LPO的含量，說明匙羹藤總皂苷在1.00～6.00mg范圍內具有抑制LPO及其代謝廢物的作用；采用試劑盒黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，測定體系中加入匙羹藤總皂苷（1.00～6.50mg/ml），可提高大鼠肝臟線粒體SOD的活性，采用試劑盒鉬酸銨顯色法測定CAT的活力，測定體系中加入匙羹藤總皂苷（1.00～6.50mg/ml），提高了大鼠肝臟線粒體CAT的活性，說明匙羹藤總皂苷能提高機體內抗氧化酶的活性，以達到間接清除自由基之目的。通過匙羹藤對大鼠肝臟細胞抗氧化能力指標LPO、SOD、CAT的影響的研究，預測其對人體抗氧化作用的功效,為其做為功能性食品添加劑的開發利用提供科學依據及開發前景。

[1] 李茜.廣西幾種特色壯藥的藥理毒性及活性成分的研究進展[J].中醫藥學刊,2005,23(12):2232-2233.

[2] 甄漢深,梁潔,周芳.廣西匙羹藤莖 95%乙醇提取物降血糖作用及其機制的初步研究[J].中國實驗方劑學雜志,2007, 13(1):32-34.

[3] 扈玉華,路建榮,朱習會.匙羹藤提取物體外抑菌活性的觀察[J].中國中醫藥信息雜志,2008,15(10):40-41.

[4] 吳耀生.新編生物化學實驗[M].北京:人民衛生出版社, 2002:120-145.

Study on antioxidant activity of total saponins of gymnema sylvestre

Objective: the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on rat liver superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and lipid peroxide (LPO) effect. Methods: by thiobarbituric acid (TBA) spectrophotometric method determination of rat liver lipid peroxidation (LPO) secondary decomposition product malondialdehyde (MDA) content, in order to examine the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on experimental rat liver LPO effect by xanthine oxidase method determination of the activity of superoxide dismutase (SOD), ammonium molybdate significantly colorimetric determination of CAT activity. The effect of the size of the total saponins of Gymnema sylvestre the role of experimental rat liver SOD and cat. Results: with the control group comparison of total saponins of Gymnema sylvestre in 1.0mg/ml-6.0mg/ml concentration range can inhibit rat liver lipid peroxidation; can improve the activity of SOD and cat in rat liver in 1.0mg/ml-6..5mg/ml concentration within the scope of. Conclusion: the total saponins of Gymnema sylvestre can improve SOD and CAT activity in rat liver, reduce the production of MDA.

Superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); lipid peroxide (LPO); gymnemasylvestre

R93

A

1008-1151(2015)11-0057-02

2015-10-11

廣西自然科學基金項目“廣西特色中草藥匙羹藤總皂苷提取工藝及生物活性研究”（2012GXNSFAA239001）。

吳華慧（1973－），女，廣西醫科大學藥學院講師，碩士，從事天然產物活性研究及醫藥化學教學工作。

李姝（1968－），女（壯族），廣西醫科大學藥學院研究員，碩士，從事天然植物提取和抗氧化活性的研究。