外泌體源性細(xì)胞外microRNAs在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究進(jìn)展*

王愛(ài)香 綜述 暢繼武 審校

·綜述·

外泌體源性細(xì)胞外microRNAs在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究進(jìn)展*

王愛(ài)香 綜述 暢繼武 審校

microRNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性單鏈非編碼微小RNAs分子，可通過(guò)堿基互補(bǔ)方式與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3' UTR）特異性結(jié)合誘導(dǎo)其降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平有效地沉默靶基因的蛋白表達(dá)。miRNAs因可以上述方式調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因表達(dá)，故其廣泛參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本文概括了miRNAs的起源、功能及生物體液中外泌體（exosome）源性細(xì)胞外miRNAs的穩(wěn)定性。同時(shí)對(duì)從尿液外泌體中尋找泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤潛在miRNA標(biāo)記物的現(xiàn)實(shí)可行性以及尿液中外泌體源性miRNAs在前列腺癌、膀胱癌及腎癌中作為生物標(biāo)記物的潛能進(jìn)行綜述。

泌尿系統(tǒng)腫瘤 細(xì)胞外miRNAs 外泌體

miRNAs是一種內(nèi)源性單鏈非編碼微小RNAs分子，長(zhǎng)度為19～23 nt，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品。目前的研究表明miRNAs在生理及病理過(guò)程中具有重要功能性意義，幾乎參與所有已知腫瘤發(fā)生的相關(guān)過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、血管形成、凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等［1］。最近的研究顯示體液中可檢測(cè)到活性細(xì)胞釋放的miRNAs，這些miRNAs統(tǒng)稱為細(xì)胞外miRNAs，通常穩(wěn)定存在于體液中而免于降解，微囊泡尤其是外泌體（exosomes）是細(xì)胞外miRNAs的一種主要保護(hù)機(jī)制且在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用［2］，其在包括泌尿道惡性腫瘤的各種人類腫瘤中被作為有前景的疾病診斷與預(yù)后生物標(biāo)記物。

膀胱癌、前列腺癌、腎癌是泌尿道三大惡性腫瘤。前列腺癌是美國(guó)男性最常見(jiàn)的癌癥，每年新診斷的患者為240 000多例［3］。膀胱癌在美國(guó)男性最常見(jiàn)的癌癥中位居第3位，據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年新發(fā)病例73 510例，死亡14 880例［3］。在我國(guó)由于人們生活水平的不斷提高及工業(yè)化進(jìn)程的加快，泌尿道惡性腫瘤的發(fā)病率與死亡率逐年增加。盡管在治療方面已經(jīng)取得很大進(jìn)步，但無(wú)創(chuàng)簡(jiǎn)便的惡性腫瘤檢測(cè)方法的發(fā)展，疾病早期的診斷水平提高仍是泌尿外科醫(yī)生需要面對(duì)的挑戰(zhàn)，同時(shí)需要回避穿刺及其他傳統(tǒng)診

斷方法對(duì)患者的損傷。就上述問(wèn)題，新近研究發(fā)現(xiàn)的外泌體源性miRNAs作為診斷及預(yù)后生物標(biāo)記物給患者帶來(lái)了曙光。

1 miRNAs的生物起源與主要功能

細(xì)胞內(nèi)miRNA分為內(nèi)源性與外源性兩種不同亞群。miRNA生物起源遵循中心法則：在細(xì)胞核中miRNA基因被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)度＞500 nt的初級(jí)miRNA發(fā)夾（pri-miRNAs）；pri-miRNAs被Drosha/DGCR8裂解為長(zhǎng)度65～75 nt的前miRNAs（premiRNAs），由Exportin 5從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿；在胞漿中pre-miRNAs被Dicer進(jìn)一步修剪為長(zhǎng)度19～23 nt的成熟miRNAs［4］。上述途徑產(chǎn)生的miRNAs組成了細(xì)胞內(nèi)大部分的miRNAs。細(xì)胞內(nèi)miRNAs的另一種來(lái)源為細(xì)胞外環(huán)境。目前研究者們普遍認(rèn)為細(xì)胞可能釋放包含miRNAs的復(fù)合物進(jìn)入血液、唾液、尿液及乳汁等生物體液中［5］，這些復(fù)合物包括miRNAs結(jié)合蛋白［6］、高密度脂蛋白（HDL）［7］、或者微囊泡。當(dāng)這些復(fù)合物在血液中循環(huán)時(shí)，可能被遠(yuǎn)隔的細(xì)胞捕獲，實(shí)現(xiàn)miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊。

成熟miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)靶mRNAs對(duì)細(xì)胞功能具有顯著影響。miRNAs與Ago 2形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），然后以完全或不完全配對(duì)方式結(jié)合到靶mRNAs的3'非編碼區(qū)（3'UTR）。如果miRNAs與mRNAs之間完全配對(duì)，靶mRNAs被核酸內(nèi)切酶裂解；如果二者間不完全匹配，靶mRNAs的翻譯被抑制。據(jù)估計(jì)，約1 000個(gè)miRNAs調(diào)節(jié)著30%以上的人類基因［8］。

2 生物體液中外泌體源性miRNAs的穩(wěn)定性及可檢測(cè)性

外泌體是細(xì)胞內(nèi)多囊泡體（multivesicular bodies，MVBs）的腔內(nèi)囊泡，在MVBs與細(xì)胞膜融合之后以胞吐的方式釋放入細(xì)胞外環(huán)境中，直徑為50～100nm。外泌體含有能反映其來(lái)源細(xì)胞生理及病理狀態(tài)的多種蛋白質(zhì)、mRNAs及miRNAs，在其形成過(guò)程中上述生物分子有一個(gè)選擇性富集過(guò)程，因此外泌體攜帶有豐富的生理或病理生物標(biāo)志物信息［5］。研究顯示外泌體被大量釋放于生物體液中，包括血液、尿液、腦脊液、惡性胸腹水、羊水及滑液等［9］。外泌體能夠攜帶RNA分子循環(huán)于血液中進(jìn)行長(zhǎng)距離的細(xì)胞間通訊，鑒于此試圖從各種體液中提取外泌體的RNA作為疾病診斷與預(yù)后標(biāo)記物研究。

用于診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的理想生物標(biāo)記物應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)無(wú)創(chuàng)性方法易于獲得，高度的敏感性及特異性，具有檢測(cè)疾病早期階段的能力，樣本有較長(zhǎng)的半衰期以及快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法等。其中無(wú)創(chuàng)性方式是最基本的獲得要求，以無(wú)創(chuàng)性方法收集的常見(jiàn)生物體液是血清與血漿，其中循環(huán)miRNAs近年來(lái)備受關(guān)注。與mRNAs相比較，循環(huán)miRNAs比較穩(wěn)定，能耐受儲(chǔ)存與凍融循環(huán)延長(zhǎng)等物理降解，同時(shí)也能抵抗血清中核糖核酸酶（RNAse）及體外RNAse A等生物化學(xué)降解［10］。在富于RNAse的血液環(huán)境中，許多機(jī)制保護(hù)循環(huán)miRNAs，其中外泌體被認(rèn)為是一種主要的保護(hù)機(jī)制［11］。外泌體的外膜對(duì)RNA提供了全面的保護(hù)，其將與易于消化的細(xì)胞外環(huán)境隔絕。以無(wú)創(chuàng)性方法收集的另一種常見(jiàn)生物體液是尿液，尿液不僅容易獲得，而且收集簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、數(shù)量大，因此尿液是一種反映泌尿系統(tǒng)疾病潛在miRNAs標(biāo)志物的理想液體。由于排泄之前尿液通過(guò)泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的病灶，因此其miRNAs含量常常反映疾病的狀態(tài)。存在于尿液中的miRNAs與循環(huán)miRNAs的保護(hù)機(jī)制大致相同，但由于尿液成分復(fù)雜，而且泌尿系統(tǒng)中存在大量的RNAse活性，使得尿液中的裸miRNAs更易于降解，因此研究源于外泌體的miRNAs更具有現(xiàn)實(shí)意義。

尿液外泌體可來(lái)源于泌尿道腫瘤（如前列腺癌、膀胱癌及腎癌）、正常泌尿上皮、腎小球或腎小管。一項(xiàng)腎臟疾病的研究中，在尿液外泌體RNA提取之前用RNase A對(duì)外泌體沉淀進(jìn)行處理，結(jié)果顯示處理組與未處理組均穩(wěn)定表達(dá)AQP2及CD24，且兩組間Ct值無(wú)明顯差異［12］。另一項(xiàng)研究分別從全尿液，尿細(xì)胞沉淀，無(wú)細(xì)胞尿液，無(wú)外泌體尿上清液及尿液外泌體中提取RNA，并對(duì)長(zhǎng)度＜200 nt的miRNAs進(jìn)行了分析，結(jié)果僅在尿液外泌體中發(fā)現(xiàn)了富集完整的miRNAs［13］。盡管尿細(xì)胞沉淀中包含了一定數(shù)目的miRNAs，但是大部分已降解。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示在3例不同受試者尿樣中應(yīng)用高通量深度測(cè)序法檢測(cè)到184個(gè)外泌體相關(guān)miRNAs，而其中僅7個(gè)miRNAs與無(wú)細(xì)胞尿液共有。上述結(jié)果表明尿液外泌體中不僅含有豐富完整的miRNAs，而且對(duì)RNAs具有很好的保護(hù)作用。

3 泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中外泌體源性miRNAs的診斷與預(yù)后意義

前列腺癌細(xì)胞外miRNAs的研究主要集中在血清與血漿。血液中存在兩個(gè)有前景的miRNAs，即miRNA-141與miRNA-375。在轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者血漿中，miRNA-141的水平是健康對(duì)照的46倍［14］。血漿miRNA-141與miRNA-375表達(dá)水平可區(qū)別轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性患者［15］，血清miRNA-141與miRNA-375表達(dá)水平與高Gleason評(píng)分及陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目相關(guān)［16］。通過(guò)從血清中分離外泌體s與微囊泡，Bryant等［15］進(jìn)一步證明，與無(wú)復(fù)發(fā)患者比較轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的miRNA-141與miRNA-375表達(dá)明顯

上調(diào)，同時(shí)研究也顯示前列腺癌患者尿沉淀與組織樣本細(xì)胞內(nèi)miRNAs中的miRNA-141表達(dá)上調(diào)，提示miRNA-141作為前列腺癌診斷與預(yù)后標(biāo)記物的潛能。在另一項(xiàng)研究中，Huang等［17］在23例激素抵抗型前列腺癌患者篩查組中進(jìn)行了RNA測(cè)序分析，并在隨訪組中對(duì)100例該類患者應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步評(píng)估血漿外泌體源性miRNAs作為預(yù)后生物標(biāo)記物的價(jià)值。結(jié)果在隨訪組中，miRNA-1290與miRNA-375的高水平與較低的總生存率明顯相關(guān)（P＜0.004）。將miRNA-1290/miRNA-375與激素抵抗型前列腺癌分期模型中的假設(shè)臨床預(yù)后因子合并后預(yù)測(cè)性能明顯提高，時(shí)間依賴性曲線下面積從0.66增加到0.73，提示血漿外泌體源性miRNA-1290與miRNA-375是激素抵抗型前列腺癌患者具有前景的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)記物。

miRNAs水平的上述改變不僅可以發(fā)生在前列腺癌患者血清及血漿中，也可能發(fā)生在尿液中。有研究報(bào)道，墨西哥的前列腺癌患者尿細(xì)胞沉淀中證實(shí)了21個(gè)miRNAs存在明顯的表達(dá)變化，miRNA-196b、miRNA-574-3p，let-7b、-7c、-7d、-7e、-7g，miRNA-200b、-149、-20b、-17、-184、-20a、-106a、-671-3p、-148a、-429、-31和miRNA-100表達(dá)明顯增加，miRNA-150與miRNA-328表達(dá)下調(diào)［18］，但這些結(jié)果仍需要在更大的患者群體中進(jìn)一步分析。另一研究為了探討miRNAs作為前列腺癌非侵襲性生物標(biāo)記物的潛能，對(duì)尿樣中經(jīng)芯片及qRT-PCR研究證實(shí)的前列腺癌組織中明顯表達(dá)失調(diào)的miRNAs進(jìn)行了分析，miRNA-205與miRNA-214表達(dá)明顯下調(diào)，二者聯(lián)合使用能區(qū)別前列腺癌患者與健康對(duì)照，敏感性與特異性分別為89%與80%，上述結(jié)果強(qiáng)調(diào)了miRNA-205與miRNA-214作為前列腺癌患者非侵襲性生物標(biāo)記物的潛能［19］。

膀胱癌診斷與預(yù)后的miRNAs標(biāo)記物研究大部分采用尿液。Hanke等［20］在膀胱癌患者尿液中確定了157個(gè)miRNAs的表達(dá)圖譜，鑒定出miRNA-126、miRNA-182與miRNA-199a的表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)尿液中miRNA-126與miRNA-152的比值能夠檢測(cè)膀胱癌，敏感性、特異性及曲線下面積分別為72%、82%及0.768。另一項(xiàng)研究表明，尿液中的miRNA-96與miRNA-183在區(qū)別膀胱癌與非癌患者方面均具有較高的敏感性與特異性，miRNA-96分別為71.0%與89.2%，miRNA-183分別為74.0%與77.3%。在該研究中與健康對(duì)照者比較，膀胱癌患者尿液中miRNA-96與miRNA-183表達(dá)水平明顯升高，但術(shù)后尿液中上述兩種miRNAs的表達(dá)水平明顯降低，此外miRNA-96與尿細(xì)胞學(xué)結(jié)合時(shí)，可將尿細(xì)胞學(xué)的敏感性從43.6%提高到78.2%，因此miRNA-96可以作為一個(gè)優(yōu)良的診斷標(biāo)記物［21］。Wang等［22］行尿液離心分離后，分別對(duì)膀胱癌患者的尿液沉淀和上清液進(jìn)行miRNAs表達(dá)研究，尿液沉淀中miRNA-200家族、miRNA-192及miRNA-155低表達(dá)，尿液上清液中miRNA-192低表達(dá)，但miRNA-155高表達(dá)。該研究的腫瘤組織切除后尿液沉淀中miRNA-200家族表達(dá)增加。上述研究結(jié)果表明miRNAs在尿液中作為膀胱癌非侵襲性生物標(biāo)記物的潛能。

腎細(xì)胞癌中關(guān)于miRNAs的研究主要描述了miRNAs在鑒別腫瘤組織與腎實(shí)質(zhì)、腎細(xì)胞癌的組織學(xué)分類及預(yù)后判斷方面的重要作用。其中僅一項(xiàng)研究［23］是關(guān)于腎細(xì)胞癌患者尿液miRNAs的檢測(cè)，miRNA-15a作為一個(gè)腎細(xì)胞癌的抑制基因促進(jìn)凋亡，同時(shí)通過(guò)與α同型蛋白酶C（PKCα）的緊密結(jié)合抑制細(xì)胞增殖，PKCα直接通過(guò)分子相互作用抑制miRNA-15a的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA-15a的細(xì)胞核釋放，降低的PKCα水平導(dǎo)致miRNA-15a表達(dá)增加。在活組織檢查與尿液樣本中，miRNA-15a上調(diào)也可能是一種鑒別透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌與良性腎腫瘤的重要生物標(biāo)記物。

4 展望

體液中提取外泌體源性細(xì)胞外miRNAs作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷與預(yù)后生物標(biāo)記物的研究雖剛剛開(kāi)始，但已經(jīng)顯示出巨大潛力。由于研究對(duì)象與方法的不同可能產(chǎn)生不同的結(jié)果，患者的招募、樣本的收集、miRNAs的提取及定量的標(biāo)準(zhǔn)化非常重要。目前的研究總體上基于小樣本患者，大樣本多中心研究亟需開(kāi)展。

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（2015-01-13收稿）

（2015-03-27修回）

Research progress on exosomal microRNAs in urologic malignancies

Aixiang WANG,Jiwu CHANG

Jiwu CHANG;E-mail:wax20030826@126.com

Micro-ribonucleic acids(miRNAs)are endogenous single-stranded small non-coding RNAs.miRNAs bind to a complementary site in the 3'untranslated region of their target mRNAs through canonical base pairing,which can direct the degradation or translational repression of these transcripts.Thus,miRNAs can effectively silence the protein expression of target genes post-transcriptionally.miRNAs may also regulate the expression of oncogenes and tumor suppressor genes and could be involved in almost all known hallmarks of cancinogenesis.In this paper,we discuss the following in detail:(1)biogenesis and main functions of cellular miRNAs,(2)stability and detectability of exosomal miRNAs in biological fluids;and(3)feasibility of miRNAs as a potential new class of biomarkers derived from urinary exosome in the malignancy of urinary system.Finally,we summarize studies on urinary exosomal miRNAs as potential biomarkers of prostate,bladder,and kidney cancers.

tumors of urinary system,extracellular miRNAs,exosome

10.3969/j.issn.1000-8179.20150060

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院天津市泌尿外科研究所（天津市300211）

*本文課題受天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（編號(hào)：13JCQNJC11500）及天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（編號(hào)：2013KZ110與2013KZ113）資助

暢繼武wax20030826@126.com

Tianjin Institute of Urology,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

This work was supported by a grant from the Application Base and Frontier Technology Project(No.13JCQNJC11500)and the Science and Technology Foundation of Tianjin Public Health Bureau of China(No.2013KZ110 and 2013KZ113)

王愛(ài)香專業(yè)方向?yàn)槊谀蛳到y(tǒng)腫瘤分子病理學(xué)及發(fā)病機(jī)制。

E-mail：wangaixiang@tijmu.edu.cn