HSP27與FAS/FASL在三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用*

張凱麗 冀宏 王影 馬維遠(yuǎn)

·臨床研究與應(yīng)用·

HSP27與FAS/FASL在三陰性乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用*

張凱麗 冀宏 王影 馬維遠(yuǎn)

目的：研究熱休克蛋白27（HSP27）在三陰性乳腺癌（TNBC）中的表達(dá)與乳腺癌臨床、病理指標(biāo)之間的關(guān)系，探討HSP27與細(xì)胞凋亡系統(tǒng)脂肪酸合成酶/脂肪酸合成酶配體（FAS/FASL）之間的相關(guān)性及其在TNBC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法：采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測100例TNBC、100例非TNBC及50例癌旁組織中HSP27及FAS/FASL表達(dá)，對HSP27表達(dá)與TNBC臨床及病理指標(biāo)的相關(guān)性以及HSP27與FAS/FASL之間表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果：HSP27在TNBC中表達(dá)顯著高于非TNBC及癌旁組織（P＜0.05），F(xiàn)AS/FASL在TNBC與非TNBC及癌旁組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HSP27與FAS的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），HSP27與FASL的表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），F(xiàn)AS與FASL的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。HSP27在TNBC中表達(dá)與不同年齡、分期、腫瘤直徑無相關(guān)性（P＞0.05），與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移枚數(shù)、P53、Ki-67的表達(dá)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：HSP27過表達(dá)與FAS/FASL系統(tǒng)表達(dá)失調(diào)可能促進(jìn)TNBC細(xì)胞增殖侵襲及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后。

三陰性乳腺癌 熱休克蛋白27 脂肪酸合成酶 脂肪酸合成酶配體

HSP27是熱休克蛋白家族的一員，作為分子伴侶具有穩(wěn)定分子構(gòu)象，具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。有關(guān)報道發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)多少與某些腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后均有關(guān)［1］。脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS）為存在于細(xì)胞表面的一種跨膜蛋白，脂肪酸合成酶配體（fatty acid synthetase ligand，F(xiàn)ASL）為FAS受體，屬于腫瘤壞死因子受體家族的成員，兩者結(jié)合可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［2］，是一條重要的細(xì)胞凋亡通路。FAS/FASL系統(tǒng)組成的凋亡通路可以誘導(dǎo)正常的細(xì)胞凋亡，但當(dāng)某些因素導(dǎo)致凋亡通路受阻，兩者表

達(dá)不平衡，就無法進(jìn)行正常的細(xì)胞凋亡、代謝，進(jìn)而誘發(fā)某些病變［3］。三陰性乳腺癌（TNBC）是近年來的研究熱點，其治療手段相對局限，內(nèi)分泌治療無效，靶向治療不適宜，預(yù)后相對較差［4］。本研究通過對TNBC與非TNBC中HSP27和FAS/FASL的表達(dá)進(jìn)行比較，探討其在TNBC發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗對象隨機(jī)選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2009年1月至2012年12月間行乳腺癌改良根治術(shù)的女性患者的病理蠟塊共200例，術(shù)后病理證實為乳腺癌，且病理資料完整。其中TNBC為100例（實驗組），非TNBC為100例（對照組），另取癌旁組織50例。患者標(biāo)本使用符合本院倫理委員會認(rèn)可。

1.1.2實驗試劑鼠抗人HSP27單克隆抗體（稀釋度1:100）、FAS/FASL兔抗人多克隆抗體（稀釋度1:100）、蘇木素、枸櫞酸緩沖液、SP-9001、顯色劑DAB、二甲苯、酒精均購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測HSP27、FAS、FASL在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)將乳腺癌組織及癌旁組織的切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過夜。脫蠟、入水，1%甲醇雙氧水、室溫10 min孵育。蒸餾水洗滌1次，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加抗原修復(fù)液、室溫10 min孵育。0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min孵育。甩去多余液體，滴加第一抗體（1:100），4℃過夜，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min，滴加生物素第二抗體（IgG），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min孵育，0.1 mol/L PBS洗滌3次×5 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，顯微鏡觀察、拍攝圖像并進(jìn)行分析。

1.2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果判定HSP27、FAS、FASL呈棕黃色顆粒表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，P53、Ki-67呈棕褐色顆粒表達(dá)于細(xì)胞核。選擇5個視野進(jìn)行免疫組織化學(xué)評分（IHS）。IHS=A×B，A為陽性細(xì)胞數(shù)分級，B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級。陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分。陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度：基本不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩者得分相乘，0分記為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），9～12分為（+++）。HSP27、FAS、FASL（++～+++）為高表達(dá)，（-～+）為低表達(dá)［5］。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料陽性表達(dá)率之間的比較采用χ2檢驗，HSP27、FAS、FASL之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中的表達(dá)

HSP27主要表達(dá)于乳腺癌組織的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖1A、1B），在癌旁組織呈低表達(dá)（圖1C）。FAS、FASL主要表達(dá)于乳腺癌組織的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖2A、2B，圖3A、3B），在癌旁組織中FAS呈高表達(dá)、FASL呈低表達(dá)（圖2C，圖3C）。

?A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues圖1HSP27在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)（S-P法×200）Figure 1Expression of HSP27 in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

?A.TNBC；B.Non-TNBC；C.Paraneoplastic tissues圖2FAS在乳腺癌及癌旁組織中表達(dá)（S-P法×200）Figure 2Expression of FAS in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

?A:TNBC；B:Non-TNBC；C:Paraneoplastic tissues圖3FASL在乳腺癌及癌旁組織中表達(dá)（S-P法×200）Figure 3Expression of FASL in breast cancer and paraneoplastic tissues（S-P× 200）

HSP27在TNBC中的表達(dá)率顯著高于非TNBC及癌旁組織（P＜0.05），在TNBC與非TNBC及癌旁組織中的FAS與FASL表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 HSP27、FAS/FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達(dá)的關(guān)系Table 1Expression of HSP27 and FAS/FASL in 100 TNBC tissue samples，100 non-TNBC tissue samples，and 50 paraneoplastic tissues

2.2HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達(dá)相關(guān)性的分析

HSP27、FAS、FASL在TNBC、非TNBC及癌旁組織中表達(dá)有相關(guān)性（圖4）。采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示FAS與FASL的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.183，P＜0.05），HSP27與FAS的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.433，P＜ 0.05），HSP27與FASL的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.555，P＜0.05）。

圖4 HSP27及FAS、FASL之間表達(dá)相關(guān)性分析Figure 4Correlation analyses among HSP27，F(xiàn)AS，and FASL expression

2.3HSP27在三陰性乳腺癌中的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的HSP27陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移枚數(shù)越多，HSP27陽性表達(dá)率越高（P＜0.01）；P53、Ki-67陽性者的HSP27陽性表達(dá)率高于陰性者（P＜0.05）。HSP27陽性率在不同年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級中的表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 HSP27在TNBC中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

表2 HSP27在TNBC中的表達(dá)及與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系（續(xù)表2）Table 2Correlation of HSP27 expression in breast cancer with patients'clinicopathologic features and tumor markers

3 討論

三陰性乳腺癌是乳腺癌的一個特殊類型，目前治療較局限，除化療以外，無相應(yīng)的靶向治療藥物，預(yù)后較差，因此探討TNBC的特異性靶點，對TNBC進(jìn)行特異性治療是目前的研究熱點［6］。熱休克蛋白家族在乳腺癌這個復(fù)雜的病理過程中起到的關(guān)鍵作用越來越受到重視。隨著對HSP27與腫瘤關(guān)系研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HSP27是一個在細(xì)胞生長、細(xì)胞骨架的穩(wěn)定、耐藥性的產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多方面起重要作用的蛋白［7］。HSP27在肺癌中的表達(dá)以及與骨肉瘤的預(yù)后關(guān)系已有報道［8］，在乳腺癌患者中HSP27也與術(shù)后短時間復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，HSP27能夠增加乳腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲能力［9］，但是HSP27與三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)系研究尚不多見。本研究的TNBC中HSP27表達(dá)明顯高于非TNBC，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多HSP27陽性表達(dá)率越高（P＜0.01），HSP27陽性的表達(dá)率在P53、Ki-67陽性者中顯著高于陰性者（P＜0.05），說明HSP27過表達(dá)與三陰性乳腺癌的預(yù)后不良存在一定的相關(guān)性，而是否能成為其預(yù)后不良的獨(dú)立相關(guān)因素尚待進(jìn)一步研究。

有研究報道，HSP27在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可以通過抑制Caspase蛋白的激活和活性來抑制細(xì)胞凋亡［10］，通過抑制癌細(xì)胞較為緩慢的衰老途徑及較為迅速的程序性死亡途徑，從而促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移［11］。因此，本研究中HSP27在TNBC中過表達(dá)，可能抑制了三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬，導(dǎo)致部分乳腺癌細(xì)胞只能以壞死方式死亡，其效率遠(yuǎn)低于凋亡，從而促進(jìn)了三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)移侵襲。另一方面，F(xiàn)AS屬于腫瘤壞死因子及神經(jīng)生長因子受體家族成員，是細(xì)胞凋亡信號受體，在許多腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)，F(xiàn)ASL在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的免疫逃避機(jī)制中起重要作用［12］。在TNBC中HSP27過表達(dá)與FAS低表達(dá)，F(xiàn)ASL高表達(dá)具有相關(guān)性，HSP27可能影響了FAS/FASL受體介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡通路［13］，HSP27直接與死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Daxx）互相作用，特異地影響Daxx通路，抑制Daxx結(jié)合到細(xì)胞膜，進(jìn)而抑制其與FAS/FASL的相互作用，最終抑制Daxx誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［14］。FAS/FASL系統(tǒng)不僅是引起凋亡的重要途徑，也是細(xì)胞免疫毒性殺傷靶細(xì)胞的途徑之一［15］。在三陰性乳腺癌中FAS表達(dá)下調(diào)，抵抗FAS介導(dǎo)的凋亡，逃避免疫監(jiān)視和免疫殺傷，F(xiàn)ASL表達(dá)上調(diào)又會引起表達(dá)FAS的T細(xì)胞凋亡，破壞自身的免疫系統(tǒng)，腫瘤細(xì)胞從而可以逃避T細(xì)胞而增殖。

總之，HSP27過表達(dá)以及FAS/FASL系統(tǒng)表達(dá)失調(diào)因素導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡系統(tǒng)不能正常運(yùn)行，可能對三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移起到了促進(jìn)作用，導(dǎo)致不良預(yù)后。

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（2014-10-22收稿）

（2015-01-23修回）

Research on the role of HSP27 and Fas/Fasl in the invasion and metastasis of triple negative breast cancer

Kaili ZHANG,Hong JI,Ying WANG,Weiyuan MA

Kaili ZHANG;E-mail:13833172900@163.com

Objective:To study the relationship between the expression of heat shock protein 27(HSP27)in triple negative breast cancer(TNBC)and the clinico-pathological indexes of breast cancer,investigate the correlation between HSP27 and the fatty acid synthetase(FAS)/fatty acid synthetase ligand(FASL)of the cell apoptosis system in the Fas/Fasl system,and study the role of HSP27 in the invasion and metastasis of TNBC.Methods:The immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of HSP27 and(FAS)/(FASL)in 100 TNBS tissue sampres,100 non-TNBS tissue sampres,and 50 paraneoplastic tissues.This method was also used to analyze the correlations between the expression of HSP27 and the clinical and pathological indexes of TNBC,as well as between the HSP27 expression and FAS/FASL expression.Results:HSP27 expression was significantly higher in TNBC than in the non-TNBC and paraneoplastic tissues(P<0.05).Statistically significant differences were observed in the FAS/FASL expression in the TNBC,non-TNBC,and paraneoplastic tissues(P<0.05).HSP27 expression had a negative correlation with FAS expression(P<0.05). HSP27 expression was positively correlated with FASL expression(P<0.05).FAS expression had a negative correlation with FASL expression(P<0.05).HSP27 expression in TNBC was not correlated with age,staging,and tumor size(P>0.05),whereas HSP27 expression was correlated with lymph node metastasis,number of nodal metastases,and P53 and Ki67 expression(P<0.05).Conclusion:The overexpression of HSP27 and the expression dysregulation of the FAS/FASL system may play a role in promoting TNBC transfer and invasion,cell proliferation,and poor prognosis.

triple negative breast cancer,HSP27,fatty acid synthetase,fatty acid synthetase ligand

10.3969/j.issn.1000-8179.20141741

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腺體外科（石家莊市050000）

*本文課題受河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃（編號：20120077）資助

張凱麗13833172900@163.com

Department of Gland Surgery,The Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China

This work was supported by the Key Research Project of Medical Science in Hebei Province(No.20120077)

張凱麗專業(yè)方向為甲狀腺、乳腺腫瘤臨床及基礎(chǔ)研究，腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制研究。

E-mail：13833172900@163.com