抑制自噬可以增加mTOR抑制劑AZD8055引起的喉癌細胞株Hep-2的凋亡

金香順 王東旭 尤 濤 (吉化集團公司總醫院，吉林 吉林 132022)

喉癌早期易于診斷，其死亡率相對較低〔1〕。資料表明吸煙和飲酒均可以增加發生喉癌的風險〔2〕。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PI3K相關激酶(PIKKs)家族成員，它有兩種存在形式，即 mTOR復合體(mTORC)1 和 mTORC2，其中 mTORC1 對雷帕霉素敏感〔3〕。mTOR參與蛋白質、核糖體生物合成和細胞凋亡等多項生理功能，而且研究表明 mTOR過度表達可以誘導多數腫瘤的發生〔4〕。體外實驗證實mTOR抑制劑在少數腫瘤細胞類型中具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用〔5〕，但是mTOR抑制劑對喉癌細胞的作用鮮有報道。增加癌癥細胞對凋亡的敏感性是癌癥研究的重要的策略〔6〕。然而，某些癌癥細胞對化療藥物產生抵抗一方面是由于不能啟動凋亡通路，還有另一方面是細胞自噬在凋亡中發揮的保護作用〔7〕。自噬抑制劑本身表現出抗腫瘤活性，而且它還能增加其他抗腫瘤藥物殺傷癌癥細胞的效應〔8〕。本研究擬考察mTOR抑制劑(AZD8055)是否能引起喉癌細胞株Hep-2凋亡以及抑制自噬是否能增AZD8055的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，AZD8055，四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司，RPMI 1640，胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2細胞株與細胞培養 人喉癌細胞株(Hep-2)細胞購自中國科學院細胞庫，培養于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和40 U/ml慶大霉素的RPMI1640培養基中，在5%CO2，37℃培養箱中培養，當細胞生長至對數生長期時進行實驗。

1.3MTT法檢測細胞活性 將Hep-2細胞以5×103/ml密度接種于96孔板(每孔加200 μl)，培養至對數生長期(24 h)，加入不同濃度藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入90 μl新鮮培養液，再加入10 μl MTT溶液，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞存活率(%)=〔A實驗孔－A空白孔/(A對照孔－A空白孔)〕×100%，實驗重復3次。

1.4Western檢測蛋白表達 將經藥物處理后的Hep-2細胞，加入細胞裂解液RIPA裂解，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳。分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，Cleaved多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)、Cleaved Caspase-3、細胞色素C抗體(Cell Signaling公司，1∶800)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次膜，15 min/次，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(Cell Signaling公司1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗3次膜，15 min/次，增強化學發光法(ECL)顯影。

1.5統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、最小顯著差數(LSD)法檢驗。

2結果

2.1AZD對Hep-2細胞生存率的影響 Hep-2細胞經過20、40、80 μmol/L AZD處理24 h后，細胞生存率均顯著下降，并呈濃度依賴性。

2.2AZD對Hep-2細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的影響線粒體功能障礙在凋亡中起著突出的作用，線粒體功能障礙導致細胞色素C，從線粒體膜間隙釋放則是多種細胞凋亡的普遍現象。PARP是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(Caspase)的切割底物。Western印跡檢測凋亡通路執行蛋白caspase-3及其底物PARP，結果如圖1所示，經不同濃度AZD處理24 h后，與對照組相比Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP呈劑量依賴性的表達增加。另外，如圖2所示細胞色素C的表達量明顯增加，與空白對照相比較差異顯著。以上結果表明AZD可以激活凋亡通路，誘導Hep-2細胞發生凋亡。

圖1 不同濃度AZD對Hep-2細胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影響

圖2 不同濃度AZD對Hep-2細胞細胞色素C的影響

2.3AZD聯合應用3-MA對Hep-2細胞生存率的影響5 mmol/L 3-MA作用Hep-2細胞24 h后，對細胞活性無顯著影響。然而，當5 mmol/L 3-MA與20 mmol/L AZD共同作用24 h后，與單用AZD組比較，細胞活性顯著降低。結果提示，3-MA和AZD聯合應用具有協同作用，可更進一步降低細胞生存率。見圖3。

圖3 AZD聯合應用3-MA對Hep-2細胞Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的影響

2.4AZD聯合應用3-MA對Hep-2細胞凋亡通路相關蛋白表達水平的影響 當Hep-2細胞經不同藥物組處理24 h后，3-MA組與對照組相比，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達水平沒有明顯改變。而3-MA與AZD聯用組與單用AZD組比較，Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP表達水平明顯增加。同樣，3-MA組的細胞色素C表達水平與對照組相比無明顯改變，而3-MA與AZD聯用組與單用AZD組比較，細胞色素C表達水平顯著增加。結果表明，聯合應用3-MA可以明顯增加AZD引起的人喉癌細胞Hep-2細胞凋亡。見圖4。

圖4 AZD聯合應用3-MA對Hep-2細胞色素C的影響

3討論

mTOR蛋白激酶發揮調控細胞生長，增殖，代謝和血管生成作用主要涉及PI3K/Akt信號通路〔9〕，而且普遍認為PI3K/Akt/mTOR信號通路在癌癥發生發展中發揮關鍵作用。諸多研究顯示該信號通路在多種類型的癌癥異常激活，它也因此在惡性腫瘤的治療方面成為了一個潛在的治療靶點〔10，11〕。本研究發現mTOR抑制劑AZD8055能增加Hep-2細胞色素C釋放增加，激活Caspase-3，誘導Hep-2細胞凋亡。該結果提示mTOR抑制劑具有明顯的腫瘤治療作用。細胞自噬可為腫瘤細胞提供能量，也促進腫瘤細胞死亡。激活mTOR及其上游信號分子能誘導細胞自噬的產生。ADZ8055為三磷酸腺苷(ATP)競爭性mTOR激酶抑制劑，能同時抑制mTORC1和mTORC2，Chresta等〔12〕發現聯合應用細胞自噬抑制劑E64d和亮肽素，可誘導細胞凋亡，且抑制細胞增殖的效果更顯著。同樣發現自噬抑制劑3-MA與AZD8055聯合應用對Hep-2細胞系的誘導凋亡作用更加顯著。因此本研究為自噬抑制劑和mTOR抑制劑聯合應用治療喉癌提供了理論基礎，同時也對尋找與研發新型靶向抗腫瘤藥物提供了新的思路。

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