阿托伐他汀對自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚的影響及其可能機制

蒲麗君 趙珂 羅勇

[摘要]目的應用阿托伐他汀抑制白發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)左室肥厚心肌過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和p21表達及其改善機制。方法隨機將同批次16只具有8周齡的自發(fā)性高血壓大鼠分為阿托伐他汀ATV組與白發(fā)性高血壓SHR組（各8只）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。采用阿托伐他汀對ATV組進行灌胃，50mg/（kg·d）；對SHR組與WKY組進行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周/次；持續(xù)干預10周后，對其血壓及血脂水平進行觀察與測量，同時計算其心肌肥厚指標，并使用RT-PCR、免疫組化觀察PPARγ和p21的表達。結果血脂及血壓觀測結果顯示，SHR組與ATV組無顯著差異，ATV組心肌肥厚指標明顯低于SHR組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；ATV組PPARγ和p21的表達明顯高于SHR組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。心肌組織PPARγ和p21 mRNA的表達表現(xiàn)出負相關性。結論阿托伐他汀可白行對白發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞中PPARγ、p21上調(diào)以對細胞周期進行調(diào)節(jié)，對高血壓左室肥厚具有改善作用。

[關鍵詞]激活受體γ；p21；自發(fā)性高血壓大鼠：左室肥厚；阿托伐他汀

[中圖分類號]R544.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）-0012-04

心血管疾病常見病之一高血壓，其心臟彩超顯示心臟由于長期受壓超負荷下為左心室肥厚，同時左室肥厚也是心臟終末心衰發(fā)展過程的共同基礎，同時也是引發(fā)高血壓患者出現(xiàn)嚴重心血管疾病的重要危險因素。參與這一病理生理過程的因素較為多樣且復雜，常規(guī)除去高血壓的影響外，細胞的增殖與凋亡失衡也與其關系密切。多種蛋白及基因?qū)毎脑鲋撑c凋亡進行調(diào)控。其中過氧化物酶體增值物激活受體γ（PPARγ）是細胞分化過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，主要參與脂質(zhì)及糖代謝，并在細胞增殖凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其在高血壓發(fā)展與左室肥厚的關系探究中具有重要觀察意義。p21可促導細胞的增殖與分化，其實增殖細胞周期的負性調(diào)節(jié)因子。他汀類藥物除具有調(diào)節(jié)血脂的作用外還能夠發(fā)揮心血管保護效應，大量研究表明阿托伐他汀可抑制膠原蛋白的合成，有抗氧化、抗炎的作用，使其可以對高血壓左室肥厚進行干預和影響。但有關基因PPARγ、p21是否參與其中目前研究較少。該研究于2014年8月12日-2014年10月14日以SHR為實驗模型，探討阿托伐他汀、高血壓左室肥厚以及PPARγ、p21之間的聯(lián)系和影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

實驗開始于2014年8月12日，歷時10周到2014年10月14日結束。24只大鼠均于重慶藤清生物技術有限公司購入，其中16只同批次的SHR、ATV以及8只WKY大鼠，均為體重在120～150g的8周齡雄性大鼠，清潔級。將16只8周齡白發(fā)性高血壓大鼠隨機分為兩組各8只，分別為阿托伐他汀組（ATV組）與白發(fā)性高血壓對照組（SHR組）；另選取8只同周齡大鼠作為正常血壓WKY組。對ATV組進行阿托伐他?。ㄝx瑞制藥有限公司）灌胃，50mg/（kg-d）；對SHR組與WKY組進行等容量蒸餾水灌胃，測量3組大鼠血壓，5周欣；持續(xù)干預10周后，每隔5周測1次血壓。10周后，觀察大鼠血壓、血脂水平，計算心肌肥厚指標，采用免疫組化及RT-PCR觀察PPARγ和p21的表達。

1.2 血壓測定

采用尾袖法無創(chuàng)式測大鼠血壓，從第八周齡開始，每5周測血壓1次。

1.3 左室質(zhì)量指數(shù)

10周后大鼠空腹稱取體重（BW），使用2.5%戊巴比妥鈉進行注射麻醉，劑量50mg/kg，腹主動脈抽取2ml血液進行檢測，分別檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。將大鼠心臟取出吸干并稱其重量（HW），并分離出左心室（包括室間隔），沖洗及吸干后稱取左心重（LVW）；計算心臟重量與體重的比值（HW/BW）以及左心室重點與體重的比值（LVW/BW），并以此作為判斷心肌肥厚的指標。白心尖部取心肌組織約4mm放入10%甲醛內(nèi)固定，用于制備組織蠟塊。剩余左心室組織保存于-80℃冰箱內(nèi)用于提取RNA。

1.4 血脂測定

將采集的腹主動脈血離心分離得到血清，采用Hitachi全自動化學分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平。

1.5 心肌組織形態(tài)學檢測

將石蠟包埋的心肌組織用石蠟冰凍切片機（LEICA SM2500E）切片，厚度為4μm，HE染色，電子顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)。

1.6 心肌細胞p21、PPARγ的分布

嚴格按照SABC試劑盒說明書進行操作。使用由美國SantaCruz公司生產(chǎn)的鼠抗鼠p21單克隆抗體以及鼠抗鼠PPARγ單克隆抗體作為一抗；由中國武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)的羊抗鼠IgG作為二抗。光學顯微鏡下顯示，心肌細胞正常狀態(tài)下呈藍色細胞核，p21、PPARγ的表達呈棕色（+）。每只大鼠均隨機抽取5張切片在x400的高倍鏡下觀察陽性心肌細胞所占比例，計算其蛋白的表達率。

1.7 心肌組織p21、PPARγ mRNA表達水平

取100mg心肌細胞標本，采用TRIzol法對標本進行總RNA提取，并使用UV-2500紫外線分光光度計算RNA純度，取2μg總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應，制備cDNA，作為PCR反應的模板。使用中國上海生工生物工程公司合成的引物具體見表1。在94℃溫度下預變5min，后進入30個循環(huán)。預變過程：預變30s后溫度降至56℃退火，30s，溫度升至72℃延伸30s.最后溫度定為74℃延伸5min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR終產(chǎn)物8μL，時間約40min，采取凝膠成像儀對條帶的灰度值進行分析，計算基因、GAPDH的灰度比作為mR-NA的表達相對量。

1.8 統(tǒng)計方法

采用統(tǒng)計軟件包SPSS 17.0對所有數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x+s）表示，多組間變量的比較采用單因素方差法分析，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。采用Spearman相關分析PPARγ和p21mRNA的表達與心肌肥厚指標的相關性。

2 結果

2.1 阿托伐他汀藥物對血壓、血脂水平的影響

ATV組和SHR組的血壓均顯著高于WKY組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而ATV組和SHR組兩組間的血壓，差異無統(tǒng)計學意義（P>O.05），見表2。10周后，ATV、SHR兩組血脂水平均明顯低于WKY組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），在阿托伐他汀干預后ATV組血脂水平與SHR組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。

2.2 阿托伐他汀藥品對心肌肥厚指數(shù)的影響

對比發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠HW/BW、LVW/BW明顯高于WKY組大鼠；ATV組上述指標均降低且與SHR組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但并未降至正常水平，與WKY組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），具體結果見表3。

2.3 心肌組織的光鏡下觀察

WKY組：形態(tài)正常，排列整齊，無明顯肥大；SHR組：形態(tài)異常、排列紊亂，明顯肥大，部分心肌纖維出現(xiàn)斷裂；ATV組：介于WKY、SHR兩組之間，形態(tài)及排列較SHR組相比較為整齊規(guī)則，心肌纖維斷裂較少，細胞肥大較少。見圖1。

2.4 免疫組化檢測結果

結果顯示：p21、PPARγ蛋白均在大鼠心肌細胞核內(nèi)表達，SHR組和ATV組PPARγ和p21蛋白的（+）表達率均低于WKY組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ATV干預后，PPARγ和p21的（+）表達率明顯上升，ATV組高于SHR組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2、圖3。

A：WKY組；B：SHR組：C：ATV組。表達（+）的心肌細胞核呈棕黃色（如白色箭頭所示），表達（一）的心肌細胞核呈藍色（如黑色箭頭所示）

2.5 RT-PCR結果

結果顯示：SHR、ATV兩組大鼠p21、PPARγ mRNA相對表達量均低于WKT組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ATV干預后，p21、PPARγ mRNA的表達均上升，ATv組高于SHR組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4、表4。

2.6 p21、PPARγ mRNA與心肌肥厚相關性

p21 mRNA的表達與HW/BW、LVW/BW均呈高度負相關，差異有統(tǒng)計學意義（r=-0.708、-0.667，P

3 討論

高血壓可使心肌肥厚、心室重構，是對心臟損傷的表現(xiàn)之一，也是引起心血管事件的獨立危險因素。研究表明，他汀類藥物除降脂外還可干預細胞周期，以此對多種腫瘤細胞和血管平滑肌細胞進行增殖與凋亡調(diào)節(jié)，但現(xiàn)如今對心肌細胞增殖與凋亡是否也通過干預細胞周期改善心室重構目前尚不清楚。

近年有研究表明，在心肌肥厚的發(fā)病機制中，p21參與其中并起到重要作用。在國外學者的研究中表明，左心室肥厚可使p21蛋白表達能力下降，引起心肌細胞肥大。且還有學者對阿托伐他汀的研究中發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過下調(diào)細胞周期蛋白相關的抑制蛋白促進細胞周期蛋白的表，使細胞衰老過程減慢。也有研究表明，他汀類藥物主要通過對p21、p27的調(diào)節(jié)實現(xiàn)對腫瘤細胞周期調(diào)節(jié)的過程。該實驗結果表明，p21表達降低可介導心肌細胞的肥大、促進心肌細胞增殖，從而參與心肌肥厚的發(fā)生。

有研究表明PPARγ的活化可能與心肌細胞肥大的負性調(diào)節(jié)有關，可抑制心肌細胞增殖，進而改善心室重構。在過去的研究中人們發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀對大鼠心肌中PPARa、PPARp、PPARγ的表達有促進作用，明顯減少了左心室壁的厚度，逆轉(zhuǎn)心室重構。也有學者對壓力負荷誘導心肌肥厚的大鼠進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀可使左心室壁厚度減小，上調(diào)PPARγ蛋白的表達。因此，PPARγ的激活應用阿托伐他汀改善心肌肥大的作用有極大關系。在該實驗中，PPARγ表達上調(diào)可改善心肌肥厚癥狀，也證實了PPARγ表達可對心肌肥厚起到負調(diào)控作用，與既往研究基本相符圈。

在心血管方面，LiM等在體外的研究結果表明，PPARγ活化可通過誘導血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-l，HO-1）的表達及上調(diào)p21的表達來抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖。Zhang D等在體內(nèi)實驗中也同樣表明，肺動脈高壓大鼠PPARγ的激活可明顯降低有心室的收縮壓，抑制有心室肥厚，部分抑制肺血管的重構，其機制可能與上調(diào)HO-1 and p21的表達有關。通過該研究可推測，阿托伐他汀可激活心肌PPARγ進行表達，間接影響p21表達上調(diào)，在兩者共同作用下抑制了心肌肥大、心室重構等癥狀，而具體作用機制有待進一步深入研究。

該研究中還發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀并不影響血脂水平，結果提示其對心臟的改善作用與血壓無關，但本文研究樣本較小，可能影響此結果。

綜上，阿托伐他汀可白行對白發(fā)性高血壓大鼠心肌細胞中PPARγ、p21上調(diào)以對細胞周期進行調(diào)節(jié)，對高血壓左室肥厚具有改善作用。