RP-HPLC定量分析人工北蟲草中3種核苷類有效成分

劉少靜，劉銀，張根，王小寧，楊黎彬

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安710021）

RP-HPLC定量分析人工北蟲草中3種核苷類有效成分

劉少靜，劉銀，張根，王小寧，楊黎彬*

（西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西西安710021）

分析5個(gè)不同品種泰山人工北蟲草中主要核苷類成分的含量并比較其差異。采用反相高效液相色譜（RPHPLC）法檢測5個(gè)樣品中尿苷、腺苷、蟲草素的含量。色譜柱為Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（7∶93），流速1.0 mL/min，檢測波長260 nm，柱溫為室溫。3種成分的進(jìn)樣量分別在5.4～540、5.2～520、5.0～500 μg/mL范圍與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r分別為0.999 4、0.999 4、0.999 2）；平均回收率分別為97.83%、98.10%、98.41%，RSD分別為2.51%、1.46%、2.21%（n均為5）。5個(gè)品種泰山人工北蟲草中主要核苷類成分含量有差異。該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，能有效鑒別蟲草的核苷類成分，可用于天然蟲草和人工蟲草中核苷類成分的分析，評價(jià)不同來源蟲草的質(zhì)量。

高效液相色譜法；北蟲草；尿苷；腺苷；蟲草素

冬蟲夏草（Cordyceps）系麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis［Berk.］Sacc.）寄生于鱗翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆蟲幼蟲上所形成的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，是我國傳統(tǒng)名貴中藥。主要分布在我國青海、西藏、四川、云南等地海拔3000m～5100m的高寒草甸區(qū)。由于自然條件的限制和近年來過度的采挖，天然蟲草資源已日益匱乏，現(xiàn)多用人工蟲草如北蟲草來滿足市場的需求［1-2］。

北蟲草在生物學(xué)分類上與冬蟲夏草同為蟲草屬，其功效與野生冬蟲夏草相近［3］。研究表明：其具有廣泛藥理活性，如抗腫瘤，調(diào)節(jié)腎功能，預(yù)防心腦血管疾病等。其中核苷類成分為蟲草的主要活性成分之一［4］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道測定冬蟲夏草中核苷類物質(zhì)含量的方法主要有薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳法（CE）等［5-6］。為了考察不同產(chǎn)地天然蟲草及人工蟲草的質(zhì)量，本研究建立了HPLC-UV定量分析5個(gè)品種北蟲草樣品中尿苷、腺苷及蟲草素3種核苷類成分。這種質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的確立也為人工北蟲草替代野生蟲草資源提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DIONEX P680A型高效液相色譜儀：美國戴安公司；FA1004B電子天平（0.1 mg）：上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；L-550臺式低速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試藥

對照品：尿苷、腺苷、蟲草素，中國藥品生物制品檢定所提供。

藥材：1號～5號人工北蟲草均由山東省萊蕪市豐忠蟲草研發(fā)種植基地萊蕪市鼎盛宏利商貿(mào)有限公司鑒定提供。

試劑：甲醇為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液=7∶93；檢測波長：260 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and the sample

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液

分別精密稱取尿苷、腺苷和蟲草素對照品適量，加超純水溶解并定容，制得尿苷、腺苷和蟲草素濃度分別為540、520、500 μg/mL的混合對照品母液。精密吸取一定量母液，加超純水定容配制成系列混合對照品溶液，其中尿苷濃度依次為：540、270、135、54、27、5.4 μg/mL；腺苷濃度依次為：520、260、130、52、26、5.2 μg/mL；蟲草素濃度依次為：500、250、125、50、25、5 μg/m。4℃冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液

分別精密稱取過40目篩的1號～5號人工北蟲草粉末各約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加水10 mL，室溫下超聲提取30 min，取出放冷，過濾，將濾液定容至25 mL量瓶中，過0.45 μm濾膜，既得供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系

精密吸取系列混合對照品溶液各10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以對照品的進(jìn)樣濃度（x）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到尿苷、腺苷及蟲草素的回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 3種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍Table 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of three components

2.4 精密度試驗(yàn)

選取一個(gè)濃度下的混合對照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得尿苷、腺苷及蟲草素峰面積積分值的RSD分別為0.46%、0.12%和0.62%，表明精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試樣品（批號120405）5份，各約1.0 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備5份樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，測得尿苷腺苷及蟲草素峰面積的RSD分別為2.43%、1.87%和3.47%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對同一供試品溶液（批號120405），于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測得尿苷、腺苷及蟲草素峰面積的RSD分別為1.26%、2.03%和1.63%。表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的同一樣品（批號120405）粗粉5份，各約0.5 g，置具塞錐形瓶中。分別加入尿苷、腺苷及蟲草素對照品適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析。計(jì)算尿苷、腺苷及蟲草素的平均回收率（n=5）分別為97.83%（RSD=2.51%），98.10%（RSD=1.46%）及98.41%（RSD=2.21%）。表明所采用的提取方法及色譜條件均具有較強(qiáng)的可靠性。

2.8 樣品測定

取5批樣品按照“2.2.2”項(xiàng)下操作，在“2.1”條件下，精密吸取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定尿苷、腺苷及蟲草素峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算含量。結(jié)果見表3。

表35 批樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Table 3 Result of content determination of 5 samples（%，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

與HPLC-DAD及HPLC-MS方法相比，本研究采用HPLC-UV（HPLC分析中最常規(guī)的檢測器）一次進(jìn)樣可將3種核苷類物質(zhì)從基線處完全分開，達(dá)到準(zhǔn)確定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分的目的。在該試驗(yàn)中，采用甲醇-水作為流動(dòng)相，為避免樣品中雜質(zhì)的干擾，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定甲醇-水最佳配比為7∶93。

3.2 提取工藝的優(yōu)化

以尿苷、腺苷及蟲草素3個(gè)目標(biāo)成分的提取率為指標(biāo)，綜合考察提取溶劑、溶劑用量、超聲時(shí)間等因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以10倍量的水超聲30 min即可基本提取完全。

3.3 含量測定結(jié)果表明，1號～5號人工北蟲草中3種核苷類成分存在明顯差異。如腺苷相差近10倍（批號120413為0.015 5%與批號120415為0.112 3%）。蟲草素相差達(dá)5倍（批號120405為0.530 3%與批號120410為0.090 8%），這可能是由于品種不同導(dǎo)致。因此，該方法的建立為天然與人工蟲草質(zhì)量的深入研究和評價(jià)提供了有利的方法和依據(jù)，同時(shí)這種質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的確立也為人工北蟲草替代野生蟲草資源提供參考。而《中國藥典》將腺苷作為冬蟲夏草的唯一質(zhì)控指標(biāo)，不能完整確切地反映冬蟲夏草的質(zhì)量，這一點(diǎn)還需要進(jìn)一步研究。

［1］梁洪卉，程舟，楊曉伶，等.HPLC定量分析冬蟲夏草的主要核苷類有效成分［J］.中藥材，2008，31（1）：58-60

［2］雷寧，杜樹山，倪雪梅，等.RP-HPLC測定天然蟲草與人工蟲草中核苷類成分的含量［J］.中國藥學(xué)雜志，2006，41（12）：948-951

［3］陸巍杰，唐永范，高瑞棟.HPLC法測定北冬蟲夏草和常見食用菌中腺苷和蟲草素［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26（4）：313-315

［4］武為寶，唐軍.皖產(chǎn)古尼蟲草中核苷和堿基成分的HPLC分析［J］.藥物分析雜志，2011，31（9）：1668-1671

［5］LI S P，LI P，ZHANG P，et al.The contents and their change of nucleosides from natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia［J］.Acta Pharm Sin，2001，36（6）：436-439

［6］黃海燕，鐘建理，謝黔鋒，等.冬蟲夏草質(zhì)量控制方法研究概況［J］.中國藥業(yè)，2010，19（9）：88-90

Determination of Nucleosides in Cultured Cordyceps by RP-HPLC

LIU Shao-jing，LIU Yin，ZHANG Gen，WANG Xiao-ning，YANG Li-bin*
（Xi'an Medical University，College of Pharmacy，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

To develop a HPLC method for the determination of the nucleosids from cultured Cordyceps，and to study the difference in them.Five samples of Cordycep from different resources were collected.Uridine，adenosine and cordycepin were determined by RP-HPLC method.The separation was performed on a Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）with UV detection at 260 nm，the mobile phase consisted of methanol-water（7∶93），the flow rate was 1.0 mL/min and the columm temperature was controlled at room temperature.The linear range of uridine，adenosine and cordycepin were 5.4 μg/mL-540 μg/mL（r=0.999 4），5.2 μg/mL-520 μg/mL（r=0.999 4），5.0 μg/mL-500 μg/mL（r=0.999 2），respectively.The mean recovery of three components were 97.83%（RSD=2.51%，n=5），98.10%（RSD=1.46%，n=5），98.41%（RSD=2.21%，n=5），respectively.The contents of nucleosides in 5 cultured Cordyceps were different from one another.The method is quick，accurate，reproducible and can effectively distinguish nucleosides in various Cordyceps.Consequently it can be used to analyze nucleosides between Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps as well as evaluate their quality.

HPLC；codyceps mjilitaris；uridine；adenosine；cordycepin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.032

2013-12-29

劉少靜（1984—），女（漢），講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)工作。

*通信作者：楊黎彬，男，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)工作。