大孔樹脂對馬鞭草總黃酮純化工藝條件優化

李先佳，任麗平，常陸林

（漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

大孔樹脂對馬鞭草總黃酮純化工藝條件優化

李先佳，任麗平，常陸林

（漯河醫學高等專科學校，河南漯河462002）

選擇7種不同型號大孔樹脂，比較其對馬鞭草總黃酮的吸附量和解吸率，篩選出AB-8為最佳吸附劑，其最佳動態吸附條件：上柱液濃度2.82 mg/mL，上柱流速為2 BV/h，pH為4.6。最佳洗脫條件：4 BV的75%乙醇濃度洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h。結果表明：AB-8樹脂對馬鞭草總黃酮具有良好的吸附和解吸效果。

大孔樹脂；馬鞭草；黃酮；吸附；解吸

馬鞭草系馬鞭草科（Verbenaceae）植物馬鞭草（Verbena officinalis L）的全草或帶根全草。味苦性涼，入肝、脾、腎經，具有清熱解毒、活血散淤及利水消腫的功能［1］，馬鞭草主要成分有黃酮類、三萜類、甾體類、糖類等［2］。近年來關于馬鞭草總黃酮的提取工藝和黃酮苷元的含量測定等方面報道較多［3］，但對總黃酮的富集純化方面報道較少。本文就大孔樹脂對馬鞭草總黃酮純化工藝進行了研究，為馬鞭草資源的開發利用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鞭草：采自河南魯山，經漯河醫專藥學系趙喜蘭副教授鑒定為Verbena officinalis L全草，60℃烘干，粉碎后過60目篩，備用。

標準品蘆丁：中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為分析純；D101型大孔樹脂：滄州寶恩化工有限公司；D4020型大孔樹脂：上海試劑一廠；樹脂（AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020）：南開大學化工廠。

1.2 儀器與設備

R-220旋轉蒸發儀：瑞士步其公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；AE240型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；真空干燥箱：上海一恒實驗儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 大孔樹脂預處理

樹脂采用95%乙醇充分浸泡24 h，分別用乙醇和去離子水洗滌至不呈白色渾濁為止。再分別用5% HCl和2%NaOH溶液浸洗，去離子水洗至中性，備用。

1.3.2 提取液的制備

取馬鞭草藥材100 g，以料液比1∶10（g/mL）加入70%乙醇1 L，回流提取3次，每次提取2.5 h，提取液濾過，合并，減壓回收乙醇，濃縮至無乙醇味，再用蒸餾水溶解制成不同濃度的溶液濾液，待用。

1.3.3 馬鞭草中總黃酮含量的測定

采用蘆丁為標準樣品，參照文獻［4］的方法繪制標準曲線，計算得回歸方程為C=0.197 8A-0.02 9，r= 0.999 4，其中C為標準溶液濃度，A為蘆丁在510 nm處吸光度值。結果表明蘆丁濃度0.016 g/L～0.16 g/L范圍與吸光度值線性關系良好。并根據該方法測定馬鞭草提取液中總黃酮的含量，以蘆丁的等價物表示。

1.3.4 大孔吸附樹脂對馬鞭草中總黃酮的靜態吸附實驗

1.3.4.1 大孔吸附樹脂的吸附量測定

量取預處理的樹脂D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020型大孔樹脂各4 g于100 mL錐形瓶中，精確加入0.63 mg/mL樣品溶液50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）吸附24 h，過濾，測定濾液中剩余的總黃酮含量，計算各種樹脂的靜態吸附量 ［Q（mg/g），Q=（C0-Cr）×V/M，C0起始濃度，（mg/mL）；Cr吸附后濃度，（mg/mL）；V為樣液體積，mL；W為樹脂質量，g］［5］。

1.3.4.2 大孔吸附樹脂的解吸率測定

取1.3.3.1方法得到的飽和樹脂，分別置于100 mL錐形瓶中，加入75%乙醇50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）解吸24 h，過濾，測定平衡液中黃酮類含量，計算靜態解吸率［A（%），A=（C×V）×100%/（M×Q），式中：C為解吸液中總黃酮質量濃度，（mg/mL）；V為解吸液體積，mL；M為樹脂質量，g；Q為吸附率，（mg/g）］［6］。

1.3.4.3 大孔吸附樹脂的靜態吸附動力學特性測定

量取預處理的樹脂各4 g于100 mL錐形瓶中，精確加入1.61 mg/mL樣品溶液50 mL，恒溫水浴搖床上振蕩（90 r/min）吸附12 h，每隔1小時測吸附液總黃酮的含量，繪制靜態吸附動力學曲線。

1.3.5 樹脂動態吸附與解吸工藝參數研究

通過靜態吸附實驗，將篩選出的理想樹脂濕法裝入層析柱中，考察上柱液濃度、上樣流速、上樣液的pH、樣液的pH對吸附效果的影響以及洗脫劑的洗脫劑乙醇濃度、洗脫劑體積、流速對洗脫效果的影響。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

2.1.1 不同樹脂對馬鞭草總黃酮的靜態吸附和解吸實驗

本實驗測定D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7種樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附率和解吸率，結果見表1。

一般而言，樹脂的吸附效果與樹脂極性、孔徑、比表面積存在一定的關系。由表1顯示，比表面積比較大的D101，D4020，AB-8的吸附率都超過81%，在這3種樹脂中，D101和AB-8兩種弱極性的樹脂吸附效果最好，這與黃酮類化合物極性較弱，有利于弱極性或非極性樹脂的吸附有關。AB-8樹脂不僅吸附效果較好，而且解吸率最佳，為87.2%。綜合分析，選擇AB-8為最佳樹脂。

表1 7種樹脂靜態吸附及解吸結果Table 1 Results of static adsorption and desorption of seven types of resin

2.1.2 靜態吸附動力學特性測定

D101，D4020，AB-8，NKA-9，S-8，D3520，H1020等7種樹脂的吸附動力學曲線如圖1所示。

圖1 樹脂靜態吸附動力學曲線Fig.1 Kinetic curves of the static adsorption of resin

圖1顯示，樹脂吸附3 h后，樹脂基本達到吸附平衡，顯示這幾種樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附屬于快速平衡型，3 h達到平衡，尤其AB-8樹脂的吸附液中總黃酮濃度下降的速度比其他樹脂快，說明AB-8樹脂吸附效果更佳。因此，本實驗選擇AB-8為最佳樹脂。

2.2 AB-8樹脂對馬鞭草總黃酮的動態吸附實驗

2.2.1 上樣液濃度的影響

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，將濃度為5.65 mg/mL蒸餾水稀釋配置成5.65、4.34、3.77、2.82、1.88、1.61、1.25、0.86、0.71、0.63、0.57 mg/mL等不同濃度的溶液，控制吸附流速為2 BV/h，進行動態吸附試驗，結果如圖2所示。

圖2 上樣液濃度對吸附量的影響Fig.2 Effect of sample concentration on adsorption capacity

由圖2可知，AB-8樹脂吸附量隨濃度的增大而加大，但達到2.82 mg/mL濃度后，吸附量變化幅度不大。綜合考慮選擇2.82 mg/mL樣品液上樣。

2.2.2 上樣速率的考察

將濃度為2.82 mg/mL的樣液分別以1、2、3、4、5 BV/h流速進行動態吸附，考察不同流速對樹脂的動態吸附效果，見圖3。

圖3 流速對吸附量的影響Fig.3 Effect of flow rate on adsorption capacity

由圖3可以看出，伴隨流速的增加，樹脂的吸附量在減少，流速過慢時，吸附量增加，但循環周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h較理想。

2.2.3 樣液的pH的確定

用稀氨水和稀鹽酸調節樣液（2.82 mg/mL）pH為2.7、3.5、4.6、5.4、6.7上柱，流速2 BV/h，考察不同pH對樹脂的動態吸附效果，見圖4。

由圖4可見，pH 4.6樹脂吸附量最大，這可能是由于黃酮類化合物多為多羥基酚類化合物，呈弱酸性，因此酸性條件下吸附量最好。但如果pH過低，容易形成烊鹽，不易被吸附。

2.2.4 上樣液體積的考察

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，將濃度為2.82 mg/mL樣液以2 BV/h流速上樣，每一個柱體收集1份，檢測流出液中總黃酮的濃度，考察樹脂動態吸附效果，見圖5。

圖4 pH對吸附量的影響Fig.4 Effect of pH on adsorption capacity

圖5 馬鞭草總黃酮泄露曲線Fig.5 Leak curve of total flavonoids From Verbena officinalis

由圖5結果顯示，上樣體積＜5 BV時泄漏較少，＞5 BV時樣液泄漏明顯，體積達11 BV時，流出液的總黃酮濃度與上樣液接近，此時樹脂已基本吸附飽和。

2.3 動態洗脫實驗

2.3.1 洗脫劑乙醇濃度的確定

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，2.82 mg/mL的上樣藥液調pH為4.6上樣流速為2 BV/h，上樣液后，依次采用2BV的去離子水，35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2 BV/h，考察不同濃度的乙醇的解吸率，洗脫液和上樣液同時蒸干，得各部分洗脫液浸膏和上樣液浸膏，見圖6。

圖6 乙醇濃度對解吸率和浸膏得率的影響Fig.6 Influence of ethanol concentration on desorption rate and extractum rate

從圖6可以看出，當乙醇濃度達到75%時，解吸率和浸膏得率最高。這可能與解吸劑的極性相關，濃度小極性過大，濃度大則極性偏小，并影響解吸效果。

2.3.2 洗脫劑用量的確定

AB-8大孔樹脂濕法裝柱，pH為 4.6上樣液（2.82 mg/mL）流速為2 BV/h上樣，充分吸附，2 BV去離子水沖洗，75%乙醇以2 BV/h流速洗脫，洗脫劑用量以1 BV為收集單位，分段收集流出液，見圖7。

圖7 黃酮動態洗脫曲線Fig.7 The dynamic desorption curve of flavonoids

從圖7可以看出，當洗脫量為4 BV時，樹脂上的黃酮基本完全洗脫。故洗脫劑用量的確定為4 BV。

2.3.3 洗脫劑流速的確定

將濃度為2.82 mg/mL樣液以2 BV/h流速通過樹脂后，充分吸附，2 BV去離子水沖洗，4 BV的75%乙醇以1、2、3、4、5 BV/h的流速洗脫，考察洗脫劑流速對解吸的影響，見圖8。

圖8 洗脫劑流速對解吸率的影響Fig.8 Effect of eluant velocity on desorption rate

從圖8可以看出，伴隨流速的增加，黃酮的解吸率在減少，但流速過慢，循環周期延長。因此，綜合考慮工作效率和吸附效果，控制流速2 BV/h較理想。

2.4 工藝驗證

按上述優選工藝進行純化試驗，純化后解吸液中總黃酮為232.14 mg，洗脫液和上樣液同時蒸干稱重分別為343.30 mg和1 327.84 mg，結果純化前黃酮為282 mg，純度為21.24%，純化后黃酮的純度為67.62%，精制倍數為67.62%/21.24%=3.18。

3 結論

7種樹脂中，AB-8大孔樹脂對馬鞭草總黃酮的吸附量和解吸率較高，為快速平衡型，是純化馬鞭草總黃酮理想的樹脂。

AB-8大孔樹脂吸附馬鞭草總黃酮的最佳工藝參數：上樣藥液濃度2.82 mg/mL，上樣流速為2 BV/h，pH為4.6。解吸工藝參數：4 BV的75%乙醇濃度洗脫，洗脫流速控制在2 BV/h。

馬鞭草提取液經過AB-8大孔樹脂分離純化后，馬鞭草總黃酮的精制倍數為3.18。

［1］金偉軍，張志東.馬鞭草的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2007，18（3）：693-694

［2］陳改敏，張建業，洪廣峰.馬鞭草中總黃酮的含量測定［J］.中國現代應用藥學雜志，2006，23（8）：798-799

［3］黃鎖義，羅建華，劉嬌，等.超聲波提取馬鞭草總黃酮及鑒別［J］.時珍國醫國藥，2007，18（6）：1464-1465

［4］劉江波，傅婷婷，呂秀陽.大孔樹脂分離純化三葉青總黃酮的工藝研究［J］.中國藥學雜志，2011，46（4）：287-292

［5］裴詠萍，李維林，張涵慶.大孔樹脂對紅鳳菜總黃酮的吸附分離特性研究［J］.時珍國醫國藥，2010，21（1）：8-9

［6］孟兆青，丁崗，柳于介，等.異長春花苷內酰胺大孔樹脂純化研究［J］.中國中藥雜志，2011，36（8）：1007-1010

Process Conditions of Purification of Total Flavonoids from Verbena Officinalis by Macroporous Resin

LI Xian-jia，REN Li-ping，CHANG Lu-lin
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Seven types of macroporous resin were selected to compare their performances in absorbing and desorbing flavonoids in Verbena officinalis.The macroporous resin AB-8 was chosen to be the best．The results indicated that the optimum condition：the extract concentration was 2.82 mg/mL，adsorption velocity was 2 BV/h，the pH was 4.6，the eluting reagent was 75%ethanol，the desorption rate was 4 BV/h．The dose of the reagent was 4 times as much as the column volume．The results showed that AB-8 resin could be used in separation an purification for total flavonoids of Verbena officinalis.

macroporous resin；Verbena officinalis；flavonoids；adsorption；desorption

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.019

2014-09-26

李先佳（1977—），男（漢），副教授，碩士，從事生物活性成分的分離與鑒定。