口服蛋氨酸造成的大鼠腎間質纖維化模型及其機制研究

1.福建醫科大學實驗動物中心 2.福建師范大學南方生物醫學研究中心 3.福州鐵路公安處刑事技術支隊

王成艷1 趙東岳2 胡興亞3

腎小管間質纖維化（Renal Interstitial Fibrosis, RIF）是由多種原因引起的細胞外基質（Extracellular matrix, ECM）成分在腎間質過度沉積，它幾乎是各種腎臟疾病進展到終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎[1]。眾多細胞因子及致纖維化介質參與了腎纖維化過程，但腎小管間質纖維化的具體發生機制目前尚不十分明確，研究證實小管上皮-肌成纖維細胞轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）在腎間質纖維化中發揮重要作用[2-4]，其中α-SMA是EMT的標志蛋白[5]。E-cad 是腎小管上皮細胞表型特異性標志物，研究證實，E-cad表達的下降在腎小管上皮轉分化過程中起重要作用[6]。

同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hcy)是蛋氨酸的中間代謝產物，是一種含硫氨基酸，Hcy在體內以蛋白結合型和游離型兩種形式存在，通過腎臟代謝和排泄。目前Hcy在心血管疾病及神經病變中研究較多，在腎臟病領域主要集中于血液透析患者。體內體外的研究表明，Hcy與腎小球纖維化密切相關[7]，Hcy能顯著促進腎小球細胞的增殖[8]，但 Hcy與腎間質纖維化有無關系卻罕有報導。葉酸(Folic acid，FA)是B族維生素的一種，是蛋氨酸循環的重要輔助因子。研究發現，FA能下調腎臟病變患者體內Hcy的濃度[9]。

對于EMT是否參與Hcy誘導的腎間質損傷以及葉酸能否對這一損傷有治療作用尚不可知。本研究通過口服蛋氨酸觀察是否造成腎間質纖維化病變，并以腎小管上皮細胞HK-2為載體，觀察Hcy對其短期增殖以及細胞活力的影響，并檢測EMT相關蛋白的表達以研究EMT是否參與此過程，摸索建立新的大鼠腎間質纖維化模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠24只，體重90 ~120g，清潔級，購于福建醫科大學實驗動物中心。隨機分為control組8只，蛋氨酸組8只，蛋氨酸＋葉酸組8只。

1.2 主要試劑

小鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體、小鼠抗人E-鈣連接蛋白單克隆抗體及小鼠抗人β-actin單克隆抗體，購于Santa Cruz Biotechnology公司；辣根過氧化物酶標記抗小鼠抗體(Evision Two-Step? Anti-mouse Detection Reagent，HRP)，購自 Antibody Diagnostica Inc；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO），購于Sigma-Aldrich公司；Masson三色染色試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司。CellTiter 96RAqueous One Solution試劑盒購于Promega公司。

1.3 模型制備及樣本留取

大鼠分為對照組、蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組，每組8只。對照組：滅菌水溶液；蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組分別按1 g/kg·d、1 g/ kg·d Met +100 mg/ kg·d FA的劑量，每日灌胃1次，共120天。造模結束后留取腹主動脈血，制備血漿，處死動物。切取一側腎臟組織，稱重，-80℃保存；切取另一側腎臟的1/3用4%的中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，4℃保存備用。

1.4 血漿同型半胱氨酸濃度測定

全自動生化分析儀檢測已制備的血漿中Hcy濃度。

1.5 Masson染色

石蠟切片4 μm厚，常規脫蠟，按Masson三色染色試劑盒完成染色。

1.6 MTT法測定細胞增殖

收集對數期生長細胞，調整細胞密度，以2×104/孔接種于96孔板，置于37℃，5% CO2培養箱培養使細胞貼壁，細胞匯合度達70%以上時，加入不同濃度的Hcy或Hcy+ FA，處理68 h，每孔加入MTS/PMS(20:1)混合液20 μL，繼續培養4 h，終止培養，在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值，繪制細胞生存曲線。

1.7 組織蛋白的提取

剪取一小塊腎臟組織，放入研缽內，冰上研磨，加入適量RIPA裂解液裂解20 min，收集裂解液，4 ℃，14000 rpm × 10 min離心，取上清液。-80℃保存，Western blot法檢測E-cad的表達。

1.8 Western blot法檢測α-SMA、E-cad的表達

以2×105/mL的密度接種細胞，待細胞貼壁后，以Hcy200，Hcy400，Hcy400 +不同濃度FA處理細胞，24h后收集細胞，RIPA裂解液裂解，超聲破碎，Bio-RAD蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，跑SDS-PAGE，250mA恒流濕轉蛋白于NC膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，α-SMA一抗（1:200）或E-cad一抗（1:1000）孵育過夜后，回收一抗，PBST洗三次，二抗孵育1 h，PBS洗兩次，PBST洗一次，曝光。

2 結果

2.1 三組大鼠的體重測定

隨機分組后，每隔兩周測定大鼠的體重，記錄整理，發現蛋氨酸組大鼠的體重較對照組有所降低（見圖1）。

圖1 各組大鼠體重變化圖

2.2 對照組、蛋氨酸組、蛋氨酸＋葉酸組血漿Hcy濃度測定

處死大鼠后，抽血制備血漿，通過生化分析儀檢測發現，蛋氨酸組能引起高同型半胱氨酸血癥，而蛋氨酸＋葉酸組卻能明顯降低血Hcy的濃度，兩組比較差異有統計學意義（p<0.05），見圖2。

圖2 血漿Hcy濃度測定

2.3 腎臟組織病理

造模結束后，行腎臟組織固定、切片，進行Masson染色。光鏡下可見對照組大鼠腎組織無明顯病理改變，蛋氨酸組可見間質明顯的藍色沉積，蛋氨酸＋葉酸組可見較弱的間質藍染。用Image-Pro Plus program 程序測定纖維化面積，以百分比表示，差異有統計學意義（見圖3）。

圖3 造模結束后，各組大鼠光鏡觀察腎間質纖維化程度比較（×400）以及纖維化面積測定

2.4 E-cad在組織中的表達

Western blot結果顯示，蛋氨酸組，蛋氨酸＋葉酸組腎臟組織中E-cad的表達顯著低于control組，見圖4。

圖4 組織中的表達

2.5 細胞活力的測定

MTS結果可見，Hcy能顯著增強HK-2細胞的增殖，與對照組相比，細胞活力明顯增強，呈現劑量依賴性（圖5）。當Hcy濃度達到400 μmol/L時，細胞活力增強明顯（p<0.01），故選此濃度為實驗濃度。

在400 μmol/L Hcy處理下，聯合不同濃度的FA處理，可見隨著FA作用量的加大，細胞活力逐漸下調（圖5）。

圖5 MTS法檢測細胞活力

H400組與control組相比，p< 0.05；H400+F400組與H400組相比，p< 0.05，差異有統計學意義。

2.6 Hcy濃度依賴性地下調E-cad、上調α-SMA的表達

Western blot結果顯示，Hcy處理后，隨著劑量的增加，E-cad的表達逐漸下調（圖6）；而單用Hcy時，α-SMA的表達顯著增加，呈濃度依賴性（圖6）。

圖6 Western blot檢測HK-2細胞中E-cad、α-SMA的表達

2.7 FA抑制Hcy誘導的E-cad、α-SMA的表達

Western blot結果顯示，FA與Hcy聯合處理下，與Hcy 400 μmol/L相比，E-cad的表達在不同濃度FA刺激下又重新上調（圖6）；α-SMA蛋白水平則隨著FA濃度增加而不斷下調（圖6）。

3 討論

Hcy是致動脈粥樣硬化的獨立危險因子，參與糖尿病腎病的發生發展過程[10]，據文獻報道，在慢性腎臟病患者中約80%存在不同程度的高半胱氨酸血癥，大約是正常人群的39倍[11]。研究顯示，口服蛋氨酸誘導的高同型半胱氨酸血癥可誘導腎小球纖維化，血中半胱氨酸的濃度可升至約30 μmol/L，而補充葉酸治療可減輕腎小球的損害，提示Hcy參與腎小球纖維化的過程[7]。Ingram等證實增加Hcy的水平最終能引起腎臟的硬化[12]，這一結果提示我們Hcy可能參與腎間質損傷。我們給予口服蛋氨酸誘導的高同型半胱氨酸血癥可誘導腎小管間質纖維化，血中同型半胱氨酸的濃度可升至約25.95 μmol/L，而補充葉酸治療可減輕腎間質的損害，提示Hcy參與腎間質纖維化的過程。本實驗中，我們觀察到Hcy的水平與細胞活力的增強，α-SMA的表達增高以及E-cad的表達下調是一致的，而葉酸干預可以降低細胞活力和α-SMA的表達。故推測血漿Hcy參與腎小管間質纖維化的機制如下：（1）Hcy促進腎臟小管上皮細胞的不斷增殖，上皮細胞的活化產生大量的細胞外基質（ECM），形成纖維化。（2）Hcy促進腎小管- 間質細胞轉分化表達α-SMA且降低E-cad的表達，這是腎纖維化進行性發展的關鍵環節，α-SMA可作為評價腎小管-間質損傷的細胞表型標志和預后的標志。

葉酸（Folic Acid, FA）又稱蝶酰谷氨酸，由喋啶核、對氨苯甲酸及谷氨酸三部分組成。葉酸是Hcy代謝途徑中蛋氨酸合成酶的輔助因子，是最有效降低Hcy水平的單一抑制劑[13]。故本實驗選擇了葉酸作為干預藥物。本實驗觀察到葉酸減低了血漿Hcy的水平，下調了α-SMA的表達，抑制了細胞增殖，減輕了腎纖維化的程度，進一步提示我們血漿Hcy水平與間質纖維化程度有關，其導致纖維化的機制與小管上皮細胞增殖及腎小管上皮-間充質轉化有關。

本實驗結果顯示，口服蛋氨酸可以通過提高血漿Hcy水平來誘導腎間質纖維化，Hcy能誘導腎小管上皮細胞的增殖，推測Hcy導致腎損傷的一個可能的機制是α-SMA的過表達以及E-cad表達的進行性減低，提示腎小管上皮細胞的轉分化，最終導致EMT的發生。葉酸能有效保護Hcy誘導的HK-2細胞增殖。

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