慢性乙型肝炎患者病毒載量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平的相關性

吳敏

·臨床與基礎研究·

慢性乙型肝炎患者病毒載量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平的相關性

吳敏

目的 探討IFN-γ、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量的相關關系。方法 收集感染科2012年6月到2014年2月的門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，同時選取在我院體檢正常或者非肝炎病毒感染患者50例作為對照組，熒光定量PCR法定量病毒載量，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體法檢測IFN-γ、IL-10水平及熒光染色測定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA定量相關關系。結果 病例組的IFN-γ水平低于對照組，而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05）。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA陰性、低拷貝、高拷貝間差別具有統計學意義（P＜0.05），其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統計學意義（P＜0.05）。IFN-γ與HBV DNA定量間呈負相關關系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現正相關關系（IL-10 r=0.362、CD19+r= 0.348，P＜0.05）。結論 IFN-γ水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量呈現負相關關系、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量間呈現正相關關系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作為乙型肝炎患者發生炎癥特異指標。

IFN-γ；IL-10；CD19+水平；慢性乙型肝炎患者；相關性

乙型肝炎是嚴重血液傳播性疾病，在世界各地均有發生，據統計全世界超過一半人感染過乙型肝炎病毒，而我國是高發地區，危害嚴重［1］。乙型肝炎分為慢性和急性兩種類型，而超過多一半的為慢性乙型肝炎［2］。慢性乙型肝炎是指乙型肝炎病毒檢測為陽性，病程超過半年或發病日期不明確并且臨床為臨床表現為乏力、畏食、惡心、腹脹、肝區疼痛等癥狀者［3］，乙型肝炎可以發生各個年齡段，主要傳播途徑有血液傳播、性傳播、母嬰傳播，一般得了都難以治愈，嚴重威脅者人們的生活質量和生命健康。現在大部分研究表明乙型肝炎病毒對肝傷害是通過介導免疫損傷后間接對肝造成損傷［4］，所以研究免疫因子與病毒載量間關系至關重要。現將我院感染科收集的2012年6月至2014年2月的門診及住院慢性乙型肝炎患者80例，應用相應檢測方法分析病毒定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平相關性，報道如下。

資料和方法

一、一般資料

收集我院感染科2012年6月到2014年2月的門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，其中男47例，女33例，年齡在20～75歲，平均（47.38±4.79）歲，病程2月～2年，平均（1.23±022）年。同時選取在我院體檢正常或者非肝炎病毒感染患者50例作為對照組，其中男26例，女24例，年齡在19～70歲，平均（46.23 ±4.37）歲。納入標準：①所有患者均符合慢性乙型肝炎臨床診斷金標準，即符合第十二次全國病毒性肝炎及肝病學術會議上通過的《慢性乙型肝炎防治指南》。②患者不合并其他嚴重并發癥，或者內分泌性疾病，或者惡性腫瘤等疾病，未服用可能對研究的指標有影響的藥物，比如未抗病毒治療等。③慢性乙型肝炎病毒感染不合并其他肝炎病毒感染，以及沒有肝臟疾病史。④符合倫理道德，家屬或者患者簽署了知情同意書等。排除標準：①患有嚴重器官衰竭性疾病，或者內分泌性疾病，比如：肝腎衰竭、糖尿病等。②患者正在接受抗病毒治療，以及合并其他肝炎病毒感染，同時可能患有影響IFN-γ、IL-10、CD19+水平的非肝炎疾病。③對本次研究不依從、不配合以及拒絕參加試驗者，或者研究過程中不按照規定進行檢查，或者在調查過程中采用了其他的治療的措施的患者及轉院治療患者。④在治療過程中病情突然的加重不能在參加試驗的。病例組和對照組，一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

二、儀器與試劑

美國biotek酶標儀、流式細胞檢測儀（貝克曼EpicsXL檢測系統）、熒光檢測儀（熒光定量核酸檢測儀）、離心機（貝克曼庫爾特Optima XPN）；ELISA雙抗體檢測試劑盒（IFN-γ：鄭州安賽生物科技有限公司、IL-10試劑盒：上海西唐生物科技有限公司）、CD19+藻紅蛋白（PE）單抗試劑（美國COULTER原裝配套）、杜邦聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒、達安DA7600 PCR儀、乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑、HBV DNA定量檢測試劑盒（珠海賽樂奇生物技術有限公司）。

三、研究方法

（一）標本來源

采取患者空腹靜脈血4 m L，3 000 r/min離心10 min，留取上層血清，-70℃保存待用；再采取2 m L EDTA-K2抗凝靜脈血用于檢測CD19+。

（二）HBV DNA水平定量檢測

應用熒光定量PCR法，儀器為達安DA7600 PCR儀。具體步驟：①血樣RNA的抽提：解凍；提取血清細胞；兩相分離（離心后混合液體將分為下層紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層）。RNA沉淀（RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊）；RNA清洗；RNA干燥；溶解RNA沉淀。②RNA質量檢測：紫外吸收法測定，先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1∶100）后，讀取其在分光光度計260 nm和280 nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。③樣品cDNA合成：逆轉錄buffer 2μL、上游引物0.2μL、下游引物0.2μL、d NTP 0.1μL、逆轉錄酶MMLV 0.5μL、DEPC水5μL、RNA模版2μL、總體積10 μL。④樣品管家基因實時定量PCR。⑤模板，針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。⑥PCR，所有c DNA樣品分別配置實時定量PCR反應體系。⑦引物設計（應用Primer Premier 5.0軟件）。⑧電泳，各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，Gold View染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。結果判斷：≥103拷貝/mL為陽性（低拷貝：103～106拷貝/ mL，高拷貝：＞106拷貝/mL），＜103拷貝/m L為陰性。

（三）IFN-γ、IL-10、CD19+水平檢測

IFN-γ、IL-10水平檢測：ELISA雙抗體法檢測，嚴格按照試劑盒使用說明書操作，使用酶標儀450 nm檢測吸光度值，通過標準曲線計算標本中的濃度。CD19+水平檢測：嚴格按照操作說明進行，首先100μL抗凝血于試管中，加入20μL PE熒光標記抗體，室溫反應20 min，加入一定量細胞裂解液，反應15 min，加入500μL鞘液混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入500μL鞘液，混勻后檢測染色陽性，計算CD19+水平。

四、研究指標

病例組與對照組IFN-γ、IL-10、CD19+水平比較；IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA水平之間相關性關系。

五、統計學方法

應用SPSS13.0統計分析軟件進行，計量資料以均值±標準差表示，檢驗符合正態分布的，行兩組之間的t檢驗，多個均值間比較應用方差分析；計數資料用百分比表示，采用卡方檢驗（χ2）；應用pearson檢驗分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA之間相關關系。取P＜0.05時差異具有統計學意義。

結 果

一、兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎指標比較

病例組和對照組性別、年齡等基礎指標之間差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性；病例組的IFN-γ水平低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05），而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

二、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與病毒載量之間相關關系

經過HBV DNA定量檢測80例患者中其中HBV DNA陰性（＜103拷貝/m L）23例、HBV DNA陽性（≥103拷貝/mL）57例，其中低拷貝的29例，高拷貝的28例。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在三種類型之間差別具有統計學意義（P＜0.05），其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統計學意義（P＜0.05），見表2。IFN-γ與HBV DNA定量間呈現負相關關系（r=-0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現正相關關系（IL-10r= 0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），見圖1、2、3。

表1 兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎指標比較

表1 兩組IFN-γ、IL-10、CD19+水平及基礎指標比較

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表2 HBV DNA對數定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平關系

表2 HBV DNA對數定量與IFN-γ、IL-10、CD19+水平關系

注：*與HBV DNA陰性間比較P＜0.05；#與低拷貝間比較P＜0.05

類別例數HBV DNA定量（拷貝/mL）IFN-γ（pg/m L）IL-10（pg/mL）CD19+（%）HBV DNA陰性23 3.12±1.24 726.24±235.18 427.28±127.89 10.89±2.26低拷貝29 5.78±1.35*613.27±220.75*564.25±144.67*13.15±2.31*高拷貝28 7.61±1.69*#421.37±198.35*#756.26±154.37*#15.58±3.15*#F -10.234-16.235 21.235 14. 000 231 P -0.001 0.000 0.000 0.

圖1 HBV DNA對數定量與IFN-γ間散點圖

圖2 HBV DNA對數定量與IL-10水平間散點圖

圖3 HBV DNA對數定量與CD19+水平間散點圖

討 論

乙型肝炎病毒感染是所有肝炎中占有比例最高的，也是影響人們生命質量最重要的一種，現在臨床上對于乙型肝炎的研究也較多，從它的發生發展各個方面都有所深入，但是對于HBV引起肝臟病變如何損傷機體還沒有一個明確認識［5］。大量文獻資料表明只有HBV引起免疫損傷才能出現肝臟病變，細胞免疫、體液免疫及可能出現的自身免疫相互關聯參與發病才能引起疾病，不同疾病類型以不同的免疫反應為主［6-7］。對于慢性肝炎主要是由于細胞免疫異常導致，有三種效應細胞分別為自然殺傷細胞（NK）、細胞毒性T細胞（TC）及抗體依賴淋巴細胞［8］。其中免疫調控細胞即輔助性T細胞（TH）與抑制性T細胞（TS）其功能低下或亢進均引起免疫紊亂。輔助性T細胞（TH）分為Th1和Th2亞群，Th1分泌IFN-γ、IL-10等細胞因子介導細胞免疫，Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10等細胞因子，可介導體液免疫，而CD19+與B淋巴細胞有關［9-10］，所以研究血液中病毒載量與細胞因子之間關系對于臨床診斷和治療有很大的作用。

本文收集我院感染科2012年6月到2014年2月門診及住院的慢性乙型肝炎患者80例，以及選取我院體檢正常或者非肝炎病毒感染患者50例作為對照，應用熒光定量PCR法定量病毒載量，ELISA雙抗體法檢測IFN-γ、IL-10水平及熒光染色測定CD19+水平，分析IFN-γ、IL-10、CD19+水平與HBV DNA定量相關關系。結果顯示病例組的IFN-γ水平低于對照組，而IL-10與CD19+高于對照組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），IFN-γ水平降低、IL-10與CD19+升高說明患者同時發生了細胞免疫和體液免疫。HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平在HBV DNA陰性、低拷貝、高拷貝間差別具有統計學意義（P＜0.05），可能說明病毒含量越高刺激機體發生免疫反應越嚴重，當機體不能耐受就會造成相應危害，其中高拷貝與低拷貝組中HBV DNA定量、IL-10及CD19+水平高于HBV DNA陰性組中水平，IFN-γ低于HBV DNA陰性組中的水平，差異具有統計學意義（P＜0.05），高拷貝HBV DNA定量、IFN-γ、IL-10、CD19+水平與低拷貝間差別具有統計學意義（P＜0. 05）。IFN-γ與HBV DNA定量間呈負相關關系（r= -0.367，P＜0.05），IL-10和CD19+水平與HBV DNA定量間呈現正相關關系（IL-10 r=0.362、CD19+r=0.348，P＜0.05），這些指標與病毒載量之間關系只是在小樣本特定地區群體中的關系，現在也沒有一個世界性多中心的相關研究，所以結果可供參考。

綜上所述，IFN-γ水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量呈現負相關關系、IL-10、CD19+水平與慢性乙型肝炎患者病毒載量間呈現正相關關系，因此IFN-γ、IL-10、CD19+水平可以作為乙型肝炎患者發生炎癥特異指標，可以通過檢測這些指標變化推斷病毒載量的情況及感染情況，進而可以制定相應的治療和預防措施。

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3 陳永琴，金文君，戴夢璐.慢性乙型肝炎患者IFN-γ、IL-10和CD19+水平水平檢測與病毒載量的關系.檢驗醫學，2013，28：315-318.

4 譚昀，張詠梅，李伏君.乙型肝炎HBV DNA檢出陽性率及病毒復制水平與乙型肝炎兩對半模式間的關系分析.當代醫學，2014，20：17-19.

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10 Du WJ，Zhen JH，Zeng ZQ，et al.Expression of Interleukin-17 associated with disease progression and liver fibrosis with hepatitis B virus infection：IL-17 in HBV infection.Diagn Pathol，2013，28：40.

2014-11-06）

（本文編輯：馮珉）

201508 上海市金山區復旦大學附屬金山醫院臨床檢驗科