鹽酸氨溴索注射液有關物質檢查方法研究

申安 樊青義 趙雨晴 王燕敏 古國領

(1.焦作市食品藥品檢驗所 河南 焦作 454001;2.鄭州通泰醫藥科技有限公司 河南 鄭州 450001;3.國藥集團容生制藥有限公司 河南 焦作 454950)

鹽酸氨溴索注射液是目前臨床廣泛應用、起效迅速、使用安全的祛痰藥，適用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸道疾病，如慢性支氣管炎急性加重、喘息性支氣管炎、支氣管擴張及支氣管哮喘的去痰治療，術后肺部并發癥的預防性治療，早產兒及新生兒呼吸窘迫癥的治療。《中國藥典》2010年版收載有鹽酸氨溴索及其口服制劑(口服溶液、片劑、膠囊和緩釋膠囊)［1］，對有關物質做了限量規定，但對注射劑未作收載。通過查閱國外藥典標準及相關資料［2－3］，得知其中可能存在雜質A(2－氨基－3，5－二溴苯基甲醇)、雜質B(反式－4－［6，8－二溴－1，4－二氫喹唑啉－3(2H)］環己醇)、雜質C(反式－4－［［(E)－2－氨基－3，5－二溴苯亞甲基］氨基］環己醇)、雜質D(順式－4－［(2－氨基－3，5－二溴芐基)氨基］環己醇、雜質E(2－氨基－3，5－二溴苯甲醛)。根據原料藥供應商提供的鹽酸氨溴索工藝流程圖分析原料藥生產工藝，雜質E是生產鹽酸氨溴索的起始原料，又是氧化降解產物;雜質B為降解產物;雜質A是起始原料雜質E引入的雜質;雜質C為反應中間體;雜質D為鹽酸氨溴索的異構體。經以上分析，在鹽酸氨溴索原料藥的質量得到控制后，雜質A、雜質C和雜質D不會在制劑過程中增加。本實驗對擬選擇的雜質B和雜質E測定方法進行了適用性研究，并對試驗樣品和參比樣品進行了對比試驗。

1 儀器與試藥

島津LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測器。

鹽酸氨溴索對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100599－200502);雜質A對照品(批號2008－01－31)、雜質B對照品(批號2010－03－24)、雜質C對照品(批號2010－01－27)、雜質D對照品(批號2010－06－107，德國LGC Dr.Sabine Schroder Product Reiease);雜質E(GR，Produot，lot:A0255146)。

鹽酸氨溴索注射液樣品(國藥集團容生制藥有限公司，規格:2 ml∶15 mg，批號11040821、11040921、11041021);參比樣品(天津藥物研究院藥業有限公司，商品名伊諾舒?，規格:2ml:15mg，批號028110);甲醇為色譜純，磷酸氫二銨、磷酸均為分析純、純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.5 mm，5μm);流動相:0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液(用磷酸調節pH至4.0)－甲醇(45∶55);流速為1.0 ml/min;檢測波長為250 nm和238 nm;柱溫:30℃;進樣量:20μl［2－4］。

2.2 系統適應性試驗 取鹽酸氨溴索對照品約5 mg，加甲醇0.2 ml溶解，再加甲醛溶液(1→100)40μl，搖勻，置60℃加熱5 min，氮氣吹干，殘渣加水5 ml溶解，得供試液①;取雜質B約1 mg，加1 ml流動相溶解，得供試液②。將供試液①、①混勻，加流動相稀釋至20 ml，取20μl注入液相色譜儀，重復進樣6次。在上述色譜條件下，250 nm波長處檢測，鹽酸氨溴索峰與降解物質(雜質B)峰的分離度分別為6.029、6.038、5.748、6.045、5.983、5.807，理論塔板數以鹽酸氨溴索峰計分別為3 662、3 471、3 041、3 544、3 551、3 396，拖尾因子在0.970～0.982之間;分離度、理論板數及拖尾因子均符合要求。保留時間RSD分別為0.98%、0.83%，峰面積RSD分別為4.9%、5.0%，保留時間和峰面積的重復性良好。

2.3 有關物質測定方法 精密量取本品適量(約相當于鹽酸氨溴索37.5 mg)，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。另取雜質B［反式－4－(6，8－二溴－1，4－二氫喹唑啉－3H)環己醇，分子式C14H18Br2NO］對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含雜質B約12μg的溶液，搖勻，精密量取適量，用流動相稀釋制成每1 ml含雜質B約1.2μg的溶液，搖勻，作為雜質B對照品溶液;另取雜質E［2－氨基－3，5－二溴－苯甲醛，分子式C7H5Br2NO］對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 ml含雜質E約7.5μg的溶液，搖勻，精密量取適量，用流動相稀釋制成每1 ml含雜質E約0.75μg的溶液，搖勻，作為雜質E對照品溶液。在上述色譜條件下測定。

2.3.1 在250 nm波長處檢測 精密量取雜質B對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液、對照溶液和雜質B對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質B峰，按外標法以峰面積計算，雜質B的含量不得過鹽酸氨溴索標示量的0.3%。除雜質B和雜質E以外，其他峰面積的和不得大于對照溶液色譜圖中主峰面積的0.4倍(0.4%)。

2.3.2 在238 nm波長處檢測 精密量取供試品溶液和雜質E對照品溶液各20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至雜質E完全出峰。供試品溶液色譜圖中如有雜質E峰，按外標法以峰面積計算，雜質E的含量不得超過鹽酸氨溴索標示量的0.2%。

2.4 已知雜質的分離

2.4.1 已知雜質定位 精密稱取雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E各適量，分別用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含雜質A、雜質C、雜質D約1μg的溶液;每1 ml中含雜質B約3μg的溶液;每1 ml中含雜質E約2μg的溶液。精密稱取鹽酸氨溴索適量，用流動相溶解制成每1 ml中含0.375 mg的溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處檢測。試驗結果:雜質A的保留時間約為7.641 min，雜質B的保留時間約為9.271分鐘，雜質C的保留時間約為11.466 min，雜質D的保留時間約為6.675 min，雜質E的保留時間約為11.146 min，鹽酸氨溴索保留時間約為5.803 min，對照品定位圖見圖1。

2.4.2 已知雜質的分離 取鹽酸氨溴索、雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E各適量，用流動相溶解制成每1ml中含鹽酸氨溴索0.375 mg，雜質A、雜質C、雜質D約1μg，雜質B約3μg，雜質E約2μg的混合溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處檢測，圖譜及數據見圖2、表1。試驗結果:各色譜峰分離良好。

圖1 鹽酸氨溴索對照品定位圖譜

圖2 混合溶液圖譜

表1 混合溶液試驗數據

2.5 輔料干擾試驗 取鹽酸氨溴索注射液處方中輔料適量，用流動相溶解制成相當于含鹽酸氨溴索150μg/ml的輔料空白溶液，在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處檢測，圖譜見圖3。試驗結果表明，在色譜中5 min前有輔料峰和系統峰。

圖3 輔料干擾試驗圖譜

2.6 專屬性試驗 為驗證本試驗方法對相關降解產物的專屬性，對鹽酸氨溴索注射液分別進行酸、堿、高溫、光照、氧化等破壞試驗，考察降解產物與主成分及已知雜質的分離情況，用來驗證擬定的有關物質檢查方法的可行性。

2.6.1 破壞前供試品 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖4、表2。

2.6.2 堿破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加5 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，80℃水浴60 min，冷卻，用5 mol/L鹽酸溶液中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖5、表2。

2.6.3 酸破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加5 mol/L鹽酸溶液5 ml，80℃水浴60 min，冷卻，用5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖6、表2。

2.6.4 高溫破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，置80℃水浴中8 h，冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖7、表2。

2.6.5 光照破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml無色量瓶中，置10 000 Lx強光下照射48 h，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖8、表2。

2.6.6 氧化破壞試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加30%雙氧水5 ml，90℃水浴10 min，冷卻，加流動相稀釋至刻度，搖勻;另取水5 ml，同法操作，作為空白溶液。在上述色譜條件下，分別進樣20μl，250 nm波長處測定，圖譜及數據見圖9、表2。

試驗結果:本品對熱、酸穩定，可被堿破壞，易被光照、氧化破壞。主峰與破壞產物峰分離良好。

圖4 破壞前供試品圖譜

圖5 堿破壞試驗圖譜

圖6 堿破壞試驗圖譜

圖7 高溫破壞試驗圖譜

圖8 光照破壞試驗圖譜

圖9 氧化破壞試驗圖譜

2.7 檢測限的測定 取鹽酸氨溴索對照品溶液，用流動相稀釋若干倍，進樣20μl，記錄主峰峰高約為基線在噪聲3倍時的色譜峰，測得鹽酸氨溴索的檢測限為0.755 2 ng。

2.8 耐用性試驗

2.8.1 波長變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將波長改變為248 nm、250 nm、252 nm，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對波長進行微小變動，主峰與雜質峰分離良好。

2.8.2 流速變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流速改變為0.8 ml/min、1.0 ml/min、1.2 ml/min，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流速進行微小變動，主峰與雜質峰分離良好。

表2 破壞試驗數據

2.8.3 流動相pH值變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流速相水相的pH值改變3.8、4.0、4.2，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流速進行微小變動，主峰與雜質峰分離良好。

2.8.4 流動相組分比例變化試驗 取鹽酸氨溴索注射液5 ml，置100 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下，將流動相組分比例改變為47∶53、45∶55、43∶57，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:對流動相組分比例進行微小變動，主峰與雜質峰分離良好。

2.9 穩定性試驗 取鹽酸氨溴索注射液適量，加流動相稀釋制成濃度為0.375 mg/ml的溶液，于室溫放置，分別于0 h、4 h、8 h，進樣20μl，250 nm波長處測定。結果:本品供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.10 雜質B檢測試驗

2.10.1 定量限試驗 精密稱取雜質B對照品，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含0.01 mg的溶液。精密量取適量，用流動相稀釋制成雜質B定量限溶液6份，各進樣20μl，250 nm波長處測定。計算雜質B定量限為3.60 ng。

2.10.2 線性與范圍 精密量取雜質B對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為:0.1μg/ml、0.6μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml的供試液，各進樣20μl，250 nm波長處測定。以樣品濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，進行線性回歸得回歸方程:y=23 853x+943.93，相關系數r=0.998 7。結果:雜質B的進樣量在3.6～23.9 ng范圍內呈良好的線性關系。

2.10.3 精密度試驗 精密量取雜質B對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為1.2μg/ml的溶液，進樣20μl，250 nm波長處測定。重復試驗6次。計算峰面積的RSD為4.3%，測定結果的重復性良好。

2.10.4 準確度試驗 精密稱取鹽酸氨溴索適量，加流動相溶解制成0.375 mg/ml的溶液9份。精密稱取雜質B對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含5μg/ml的溶液②。精密量取溶液②適量，加入鹽酸氨溴索溶液中，制成含雜質B約1.0μg/ml、1.2μg/ml和1.4μg/ml的溶液各3份作為供試液，各進樣20μl，250 nm波長處測定。計算雜質B的含量，各濃度的平均回收率在103.3%～109.4%，RSD為3.8%。

2.11 雜質E檢測試驗

2.11.1 定量限試驗 精密稱取雜質E對照品，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含2μg的溶液。精密量取適量，用流動相稀釋制成雜質E定量限溶液6份，各進樣20μl，238 nm波長處測定。經計算，雜質E定量限為1.734 4 ng。

2.11.2 線性與范圍 精密量取雜質E對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約:0.20μg/ml、0.35μg/ml、0.50μg/ml、0.75μg/ml的供試液，各進樣20μl，238 nm波長處測定。以樣品濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，進行線性回歸得回歸方程:y=37 208x+144.55，相關系數r=0.999 6。結果:雜質E的進樣量在1.74～14.64 ng范圍內呈良好的線性關系。

2.11.3 精密度試驗 精密量取雜質E對照品溶液適量，用流動相稀釋制成濃度約為0.75μg/ml的溶液，進樣20μl，238 nm波長處測定。重復試驗6次。計算峰面積的RSD為3.9%，測定結果的重復性良好。

2.11.4 準確度試驗 精密稱取鹽酸氨溴索適量，加流動相溶解制成0.375 mg/ml的溶液9份。精密稱取雜質E對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 ml中含1μg/ml的溶液②。精密量取溶液②適量，加入鹽酸氨溴索溶液中，制成含雜質E約0.60μg/ml、0.75μg/ml和0.90μg/ml的溶液各3份作為供試液，各進樣20μl，238 nm波長處測定。計算雜質E的含量，各濃度的平均回收率在9.64%～104.8%，RSD為3.9%。

2.12 樣品測定 按上述有關物質檢查方法的色譜條件，測定樣品及參比樣品，檢查結果無明顯差異，結果見表3。

3 討論

鹽酸氨溴索原料中可能存在雜質A、雜質B、雜質C、雜質D、雜質E。雜質E是生產鹽酸氨溴索的起始原料，又是氧化降解產物;雜質B為降解產物。通過專屬性破壞實驗，可以看到隨著鹽酸氨溴索的降解，雜質B和雜質E的含量發生明顯增加，所以應將這兩種雜質作為控制鹽酸氨溴索注射液質量的主要指標進行檢測。

表3 鹽酸氨溴索注射液有關物質檢查結果(%)

通過查閱國外藥典標準及相關資料，選定了流動相的成分為0.01 mol/L磷酸氫二銨溶液(用磷酸調節pH至4.0)和甲醇，兩種成分經過篩選，確定了比例為45∶55。在此系統條件下，鹽酸氨溴索注射液的各種雜質能夠進行良好的定位和分離，并且對主要檢測指標雜質B和雜質E檢測方法的驗證試驗結果滿意。方法學研究結果表明本方法簡便、快速、準確，可以用于鹽酸氨溴索注射液有關物質的檢查。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:765－768.

［2］JX20030067.進口藥品注冊標準［S］.

［3］The Quality of Medicines of the Council of Europe.European pharmacopoeia［M］.4th ed.Germany:Druckerei C.H.Beck，Nordlingen，2002:625.

［4］紀傳俠，孟科，李雯，等.HPLC法測定注射用鹽酸氨溴索中的含量及有關物質［J］.化工時刊，2008，22(4):40－42.