脂肪球膜中脂類的組成及測定方法

秦書云，于景華

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457）

0　引 言

從目前市場反饋來看，脂肪上浮現象是長貨架期UHT乳普遍存在的質量問題，脂肪上浮所呈現的感官質量問題，會影響消費者的購買欲望。脂肪以液滴或球狀形態穩定分散于乳中，這些脂肪球被一層薄膜包裹，稱為MFGM，脂肪上浮與MFGM的穩定性密切相關。現今，國內外對于MFGM脂類的研究關注較少。而脂類在MFGM中作為骨架，以流動狀態存在，其變化情況直接影響乳制品的穩定性及其品質，MFGM中的脂類也具有獨特的營養學意義及應用前景。因此，測定MFGM中脂類的組成對提高MFGM穩定性，解決牛乳脂肪上浮問題，提高牛乳品質及乳品工業中MFGM副產品的利用率具有重要意義。

1　MFGM中脂類的營養學意義

在MFGM中，SM是鞘脂的主要組分具有重要功能，其代謝物具有高度的生物活性，作為脂質的二級信使參與細胞的跨膜信號傳導、調節生長、增殖分化和凋亡等。磷脂具有乳化、增強記憶力，預防老年癡呆，活化細胞等功能，不同種類的磷脂具有不同的功能，如PS可以提高高強度運動的能力；PC促進對記憶重要的神經遞質的合成和傳遞，利于腦發育等。MFGM的極性脂質是具有疏水性尾部和親水性頭部的兩親性分子，一方面這大大有助于提高膜的乳化能力，在食品工業中常被用作乳化劑；另一方面在保持表皮的保水性方面起重要作用，不僅在化妝品行業中具有巨大的商業潛力，此外，還可以制備制藥口服液和脂質體制劑。制作黃油時產生的副產品酪乳，價格低廉且產量高，酪乳產量約占黃油產量的1.7～1.8倍，但多年來一直被認為是無價值的。然而，酪乳的MFGM含量高，現已廣泛作為研究MFGM材料的來源[1]，越來越多的研究者致力于酪乳中MFGM脂類的組成和分布的研究，定性、定量測量方法的探索。

2　MFGM中脂類的組成和分布

MFGM是由蛋白磷脂膜構成的厚度為10～20 nm的三層膜結構[2]。由磷脂和蛋白質組成的外脂雙層膜結構被描述為一個流動狀態的鑲嵌模型，磷脂是模型的骨架，以流動狀態存在，支持球狀蛋白質分子，部分嵌入膜內，部分從膜內伸出，使整個脂肪球膜保持一個穩定的框架。

MFGM中脂類成分相對復雜，其成分組成、結構分布，根據不同的測定方法而略有差異，目前，尚未形成統一的定論，有待于進一步探索。

2.1　MFGM中脂類的組成成分

Carmen[3]認為MFGM中的脂質主要由甘油三酯（56%）和磷脂（40.6%）組成，還有少量的葡糖苷酰鞘氨醇(G luCer)、乳糖酰基鞘氨醇(LacCer)和痕量的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和溶血卵磷脂(LPC)。在磷脂中，其組成成分如下：磷脂酰膽堿（PC，31%）、磷脂酰乙醇胺（PE，30.5%）、鞘磷脂（SM，19.9%）、磷脂酰肌醇（PI，7.1%）、磷脂酰絲氨酸（PS，5%）、LacCer（3.4%）、GluCer（0.3%）。這與El-Loly[4]的研究結果非常相似，由此可以認為磷脂的測定結果有很高的可信度。

此外，El-Loly對于MFGM中極性脂質的結構也有闡述。他認為MFGM中的極性脂質主要分為磷脂類和神經鞘脂類兩大類。這兩類脂類都是具有疏水尾部和親水頭部的兩親性分子。磷脂的甘油骨架上有兩個脂肪酸酯，第三位的羥基可以連接帶有不同基團的磷酸鹽殘基。神經鞘脂類的特征性結構單位為長鏈鞘氨基醇，含2～3個羥基基團。鞘氨基醇的氨基與脂肪酸連接后形成神經酰胺，通過連接不同有機磷酸酯基團形成鞘磷脂或連接糖類后形成糖脂[5]。

2.2　MFGM中脂類的原位分布

MFGM中的脂類，尤其是磷脂的組成和分布在MFGM的構建方面發揮著重要的作用，進而很大程度上影響著MFG及整個牛乳體系的穩定性。因而，很有必要對MFGM中的脂類進行原位測定，從直觀上確定MFGM的微觀結構，對確立牛乳脂肪體系的穩定性與MFGM的結構框架之間的聯系有重要意義。

目前，大都采用相配適的染色劑進行染色處理后的親脂性熒光探針對MFGM中的脂類進行標記，再利用激光共聚焦顯微鏡（CLSM）對MFGM中的脂類進行測定。Lopez C[6]將磷脂用熒光染料R h-DOPE染色后，如圖1（a）中箭頭所示，分別表示M FG的核心三酰基甘油（TAG）和其周圍的非熒光結構域，在圖1中MFGM的結構第一次被表示為至少由兩種脂相共存于MFGM中：（1）液相無序（Ld）區：甘油磷脂（PE，PC，PI，PS），蛋白質，糖蛋白；（2）液相有序（Lo）區：SM和膽固醇。剛性的Lo區被Ld區所包圍。這第一次證明了極性脂質的非隨機分布。同時，圖1（a）～（e）中的CLSM圖像可以看出，SM和膽固醇分散在MFGM中的各種大小和形狀的Lo區（黑色的非熒光結構域）并發生側向偏析。在甘油磷脂的Ld區中R h-DOPE熒光探針發射紅色的熒光顯示出富含SM的結構域，用小箭頭表示連接富含SM的結構域的通道。由于MFGM中的脂類種類繁多，可以探索用不同的相配適的染色劑對MFGM中相應的脂類染色后再用CLSM進行觀察，為以后直觀觀察MFGM中的脂類提供一條高可行度的實驗思路，有待于進一步完善和探索。

Zou[7]將磷脂用熒光染料R d-DOPE染色后，得出了與Lopez C關于MFGM中的脂類分布相似的結論，同時闡述了這種脂類結構分布的原因。Zou認為在MFGM中作為三極體的極性脂質的極性頭基團暴露于水性環境，烴尾部在雙層的中心形成疏水區域或與三酰基甘油核心接觸。同時，他發現甘油磷脂的分子長度小于SM分子，推測可能是由于SM具有長鏈飽和脂肪酸和類鞘氨醇堿的直鏈結構，而甘油磷脂具有不飽和脂肪酰基鏈的扭結結構。在MFGM雙層結構中SM分子的尾部之間可能存在相互交錯，膽固醇可以填充SM頭部之間的空隙。但是在MFGM對稱雙層的兩個單葉上或僅在MFGM不對稱雙層的外部小葉上存在富含SM的Lo區的問題仍未有定論，有待進一步研究。由于SM側向遷移形成剛性Lo區導致MFGM的厚度存在局部差異，富含SM的Lo區從甘油磷脂結構域突出約5-9，可能是此結構域缺乏Ld區的蛋白質和糖基化分子（糖蛋白，糖脂）。因此，研究MFGM中的鞘磷脂在各種加工（加熱、均質）過程中的遷移變化，可以推測出MFGM厚度的差異，對探索MFGM的結構與牛乳脂肪體系的穩定性有重要意義。

圖1　Rh-DOPE探針染乳脂肪球膜結構的激光共聚焦顯微圖

3　MFGM中脂類的定性測定

3.1　TLC

定性測定MFGM中脂類較為常見的方法為TLC，它是利用組分分子與展開劑分子爭奪吸附劑表面活性中心而將MFGM中脂類進行分離。其中，展開劑的種類對脂質分離效果的影響舉足輕重，展開劑的選擇主要是根據被分離物質的極性、展開劑的極性和吸附劑的活度。

Benoit[8]根據MFGM的極性脂質與非極性脂質極性大小的不同，在G 60?的TLC硅膠板上以正己烷：乙醚：乙酸（80∶20∶1，體積比）組成的溶劑系統為展開劑，將MFGM的極性脂質與非極性脂質進行了有效分離；用C 13∶0(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)做內標，以乙醚：己烷：乙酸（150∶150∶3，體積比）組成的溶劑系統作為展開劑將中性脂質的甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯進行了較好的分離，但是并沒有將MFGM的極性脂質進行細化分離。今后我們可以優化展開劑的配比，將MFGM中各種極性脂質進行分離。

2D-TLC在保留1D-TLC的幾乎所有優點的基礎上，擴增了峰容量，可以實現成分更為復雜的脂質的精確分離。這種方法在分離MFGM的混合脂質中也有廣泛的適用性。我們可以用一種展開劑首先將混合脂中的極性脂與中性脂分離，然后再用更加精準的展開劑將兩部分脂質進行深度細化分離，Bertram[3]在G 60?TLC板用C 13∶0(甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯)做內標，利用氯仿∶甲醇∶水（60∶35∶5，體積比）為展開劑從板的頂部邊緣到大約5 mm，分離磷脂至中途，再利用己烷：乙醚∶乙酸（70∶30∶1，體積比）為展開劑分離中性脂質[5]，這樣我們用2D-TL相比1D-TLC，減少了樣品處理次數，操作簡便、效率高、適用性強，結果重現性高。

但是這兩種方法都只能將MFGM中的脂類分離定性，無法精確測定其含量，只能通過灰度掃描儀根據分離出脂質條帶的顏色深淺進行半定量。

3.2　拉曼光譜法

相比于TLC法分離鑒定MFGM中的脂類，拉曼光譜法在不破壞天然脂肪球構型的情況下進行測定，它能夠從單個脂肪球獲得特定拉曼信號。在拉曼光譜中觀察各種脂質的拉曼峰及主要振動條帶，與脂質標準品相比較，進而判定其成分及飽和度變化，進行定性分析。LUO[9]將牛奶制備成觀察樣品，利用拉曼光譜測定特定脂肪球及膜的脂質和脂肪酸組成。1 303和1 443 cm-1的振動條帶，為特定的CH2基團的振動，對應于磷脂。875 cm-1的振動條帶對應于膽堿化合物，1 630 cm-1的C=C順式不飽和的振動對應于PC，PI和PS，可以定性地將MFGM中的脂類測定出來。拉曼光譜定性測定MFGM中的脂類的優越性在于不需要任何化學標記手段就可以實現對靜態樣品的快速檢測。單個脂肪球分子能在天然狀態下被固定，保持其天然構型，同時獲得單個分子的拉曼光譜信號。然而，現有應用拉曼光譜分析MFGM中的脂類的研究較為缺乏，需要進一步探索、完善。

4　MFGM中脂類的定量測定

4.1　GC-MS

Benoit[10]利用GC-MS法，將極性脂質用氯仿∶甲醇∶水（5∶5∶1，體積比）組成的有機溶液體系萃取，再用BF3甲醇溶液進行甲基化，以H e作為載氣，通過與標準品比較保留時間，計算其相對含量。測定出MFGM中磷脂組成為PC（50%），PS（40%），PI（36%），PE（25%）。另外，作者還闡述了PC具有最高的飽和脂肪酸組成，是在隔離SM和膽固醇中起主要作用的磷脂，而PE具有最低的飽和脂肪酸含量，可以加大膜的流動性。此外，Juanes[11]也利用GC-MS法，用BF-

3甲醇溶液將磷脂在石油醚中反甲基化，以H e作為載氣，通過與標準品比較保留時間，計算相對含量。通過 GC-MS測定出 PC（21.2%～35.1%）；PE（19.8%～46.3%）；SM（19.8～31.4%），與Benoit測定的MFGM中脂類的組成和含量相似。說明利用GC-MS測定MFGM中的脂類可行度高，GC-MS既有GC高效分離的優點，又兼具MS特異鑒別的長處，能對混合物中已知組分進行準確的定量分析，GC-MS已成為一種高效互補的分離分析技術，應用于MFGM中的脂類測定的領域[12]。

4.2　LC-MS

Bertram[3]用磷脂標準品和正相LC洗脫的磷脂進行MS測定，來鑒定各種磷脂物質和磷脂脂肪酸組成。LC-MS法測定出MFGM脂質組分主要為甘油三酯（56%）和磷脂（40.6%），其次還有少量的乳糖基和葡萄糖腦苷脂，痕量水平的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿也能檢測到。這與2.1所述MFGM中脂類的組成和含量相似，此外，他也對磷脂脂肪酸組成進行測定，其中與甘油磷脂相關的脂肪酸主要是C 16∶0，C 18∶0，C 18∶1，C 18∶2，鞘磷脂中豐富的脂肪酸為C 20∶0，C 23：0，C 24∶1，C 24∶0，鞘脂基的主要脂肪酸為C 16∶1，C 17∶1，C 18∶1。另有研究表明，MFGM中甘油三酯的較高的飽和脂肪酸含量有助于維持MFGM的穩定性，因此測定牛乳在不同加工條件下，MFGM中甘油三酯的飽和脂肪酸的含量變化，可以推測MFGM和牛乳體系的穩定性。LC-MS兼具液相色譜的高分離和質譜提供結構信息的特性，具有靈敏度高、選擇性強，易得豐富、有效結構信息的優點，可以提供更好的分離能力，降低分析物的檢測限，并提高分析速度，從而可實現MFGM中脂類的快速、高通量分析[13]。

GC-MS具有較好的分離效率且相對較經濟，但柱前衍生費時費力不能滿足較大樣本量的分析，且衍生產物的不穩定性不可避免。上述缺陷使它僅在分析脂肪酸上應用較多，脂肪酸的分離能力優于LC-MS，在測定復雜脂質分子上具有局限性。如MFGM中的TAG，將其衍生化后用GC-MS進行定量分析，高溫易破壞TAG結構，耗時長，適用性不如LC-MS。而LC-MS，對于MFGM中脂類的測定，不經LC分離直接用MS分析常常遇到基質干擾問題。LC的模式多，適合復雜的脂類化合物的分離，且無需衍生化，LC-MS能夠提供可靠、精確的相對分子質量及結構信息，具有高分辨率、高靈敏度和特異性等優點，因此，LC-MS越來越多地用于MFGM中脂類的測定中。

4.3　HPLC-ELSD

Rom baut[14]用HPLC-ELSD法分析極性脂質。以1 L/min的N2作為霧化氣，在等體積條件下用氯仿/甲醇/三乙胺（87.5∶12∶0.5，體積比）緩沖液洗脫。通過與標準品的保留時間進行比較來進行極性脂質的分析。測定結果為MFGM中極性脂質組成為 PE30.23%，SM 27.36%，PC 25.2%，PI9.89%，PS7.32%。MFGM中極性脂質組成成分與2.1所述相似，但含量略有差異，不同的極性脂質具有不同的性質，極性脂質組成可以極大地影響其微觀結構，因此，需要進一步完善、改進此方法在MFGM中極性脂質測定中的應用。HPLC-ELSD在MFGM中極性脂質測定中具有基線穩定、分離效果良好、結果準確、樣品處理簡單等優點[15]，有廣泛的應用前景。

但LC-MS分析時間較長，樣品在過柱中會有部分損失。HPLC-ELSD適用于分析沒有紫外吸收或者吸收很弱的大分子有機化合物，也已用于MFGM中脂類的定量分析。如腦苷脂和神經酰胺，研究MFGM中脂類活性構效關系需要解析其結構，然而，MFGM中脂類的神經酰胺和腦苷脂種類繁多，難以鑒定其結構和分子種類。LC-MS雖也可對其進行測定，但需對樣品進行前處理，且操作復雜、重復性差，無法具體獲得每個腦苷脂和神經酰胺分子的準確結構信息，只能獲得大致比例情況，不適合用于MFGM中少量鞘脂的分析。綜上所述，以上3種方法在分析MFGM中的脂類中較為常用，但是每種方法都有自己的優勢和局限性，需要根據MFGM中的脂類的具體性質來確定檢測方法，并進一步改進和完善。

5　展 望

對于MFGM中脂類的測定方法及其結構組成的研究尚處于起步階段。因而，需要進一步明確MFGM中脂類的組成成分和分布情況，例如通過zeta電位分析脂肪球在乳體系中的穩定性，物理反射模型的背散射光檢測技術利用穩定性分析儀測定牛乳脂肪在不同處理條件下MFGM的穩定性；通過共聚焦激光顯微成像和透射電鏡分析等脂肪球的形態變化等；運用二次回歸通用旋轉組合設計方法研究均質、溫度和牛乳中強化的營養素對牛乳脂肪穩定體系的影響，并建立數學模型，發現再造工藝條件與牛乳中脂肪體系穩定性之間的聯系，最后通過優化工藝條件，以達到抑制牛乳中脂肪上浮和提高乳品工業富含MFGM的副產品開發潛力的目的。

參考文獻：

[1]VANDERGHEM C,BODSON P,DANTH INE S,et al.Milk fat globule membrane and buttermilks:from cm position to valorization[J].Biotechnol.Agron.Soc.Environ,2010,14(3):485-500.

[2]王紫薇，羅潔，彭海鑫，等.乳脂肪球膜的研究進展[J].中國奶牛，2014，18:34-39.

[3]FONG BY,NORRISCS,ALASTAIR KH,et al.Protein and lipid composition of bovine m ilk-fat-globule membrane[J].International Dairy Journal,2007,17:275–288.

[4]EL-LOLY M.Composition,Properties and Nutritional Aspects of Milk Fat Globule Membrane—a Review[J].Polish Journal of Food and Nutrition Sciences,2011,61(1):7-32.

[5]LOPEZ C.M ilk fat globules enveloped by their biological membrane:Unique colloidal assemblies with a specific com position and structure[J].Current Opinion in Colloid&Interface Science,2011,16:391-404.

[6]LOPEZ C.Lipid domains in them ilk fat globule membrane:Specific role of sphingomyelin[J].Lipid Technology,2010,22(8):175-178.

[7]ZOU XQ,GUO Z,HUANG JH,et al.Human milk fat globules from different stages of lactation:a lipid composition analysis and micro structure characterization[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(29):7158–7167.

[8]BENO IT B,FAUQUANT C,DAIRA P,et al.Phospholipid species and minor sterols in French human milks[J].Food Chemistry,2010,120(3):684-691.

[9]JIE L,YUHAN W,YIQ IL,et al.Lipid Composition of Native Milk Fat Glouble by Confocal Raman Microscopy[J].Spectroscopy and Spectral Analysis,2016,1:125-129.

[10]EL-ABASSY RM,ERAVUCH IRA PJ,DONFACK P,et al.Fast determination of milk fat cintent using Raman spectroscopy[J].Vibrational Spectroscopy,2011,56(1):3.

[11]SANCHEZ-JUANESF,ALONSO JM,ZANCADA L,et al.Distribution and fatty acid content of phospholipids from bovine milk and bovine milk fat globule membranes[J].International Dairy Journal,2009,19:273-278.

[12]RU X,LIANG Y,YU C,et al.Correlation between GC fingerprint and chemical component froMShuanghuanglian Injection[J].Chi Traditional PatM ed,2010,32(11):1845-1849.

[13]姜艷彬,單吉浩,王瑩,等.LC-MS/MS技術在藥物代謝研究中的應用進展[J].藥物分析雜志,2014,(3):385-391.。

[14]ROMBAUT R,CAMP J,DEWETTINCK K.Analysis of phospho-and sphingolipids in dairy products by a new HPLC method[J].Journal of Dairy Science,2005,88(2):482-488.

[15]林慧,顏春榮,徐春祥,等.HPLC-ELSD法同時測定食品中的10種糖和糖醇[J].食品科學,2013,12:286-291.