rMBP－NAP依賴IL－12/IL－23軸對肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

王小龍 康巧珍 門穎麗 黃夏冰 張亞萌 劉鑫

(鄭州大學生命科學學院 河南鄭州 450001)

IL－12是一種異源二聚體型促炎性細胞因子，主要由固有免疫細胞如樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等表達[1]。IL－12在連接固有免疫和獲得性免疫中起到了重要作用，并在抗腫瘤免疫研究中受到重視。通過IL－12蛋白藥物或者IL－12基因藥物處理荷瘤小鼠發現，IL－12能顯著性抑制腫瘤的生長，其抗腫瘤作用依賴于誘導IFN－γ的高表達[2]。IL－23是同屬于IL－12家族中的另一個細胞因子，其與IL－12具有相似的結構，兩者具有相同的p40亞基[3]。近年來，隨著對IL－23生物學功能研究的深入，IL－23在抗腫瘤中的作用也逐漸受到重視。IL－23能夠引起CD8+T在腫瘤組織中的大量浸潤，發揮抗腫瘤作用，IL－23的抗腫瘤作用的發揮與細胞因子IFN － γ 表達量增加正相關[4－5]。

幽門螺桿菌中性粒細胞激活蛋白(Helicobacter pylori neutrophil－activating protein，HP－NAP)是幽門螺桿菌重要的毒力因子，同時HP－NAP也是一種TLR2激動劑，能夠激活中性粒細胞和單核細胞中的TLR2信號通路，并促進其分泌IL－12和IL－23細胞因子。同時，經HP－NAP刺激的中性粒細胞和單核細胞與T細胞共培養后，能夠增強T細胞分泌IFN－γ，即促進Th1型免疫反應[6]。有研究證實，HP－NAP具有抑制小鼠H22荷瘤模型腫瘤生長的作用，其中伴隨著分泌IFN－γ的T細胞數目的增加[7－8]。結果提示，IFN－γ在HP－NAP發揮免疫調節功能乃至發揮抗腫瘤作用的過程中具有重要作用。而IL－12/IL－23在IFN－γ介導的HP－NAP誘導的抗腫瘤作用中的角色有待于進一步的研究。

本實驗室通過分子克隆的方法構建HP－NAP的原核表達載體，成功純化得到了重組中性粒細胞激活蛋白rMBP－NAP，并在小鼠H22肝癌腫瘤模型中對其抗腫瘤作用進行了評估。進一步利用抗體分別阻斷IL－12和IL－23，檢測IFN－γ的表達，探究rMBPNAP依賴于IL－12/IL－23的抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 rMBP－NAP蛋白由本實驗室通過Amylose Resin(nEB，England)親和層析純化獲得;BCA蛋白定量試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司;RPMI－1640培養基購于北京索萊寶生物科技有限公司;胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司;IFN－γ ELISA試劑盒購于Biolegend;抗體IgG Control、小鼠anti－IL－12抗體及小鼠anti－IL－23p19抗體購于美國R＆D systems;絲裂霉素 C(MMC)購于Genview。

1.1.2 實驗動物 SPF級雌性6～8周 BABL/c小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXK(京)2012－0001。飼養于河南省醫藥科學研究院SPF級動物室，試驗過程中動物自由飲食飲水，光照周期為12/12 h。

1.1.3 腫瘤細胞 H22小鼠肝癌細胞系，由河南省醫藥科學研究院惠贈，培養并保存于本實驗室。

1.2 方法

1.2.1 H22荷瘤小鼠模型建立及治療 將2×106個H22細胞以0.2 ml體積量皮下注射BABL/c小鼠左前肢腋下，荷瘤后第2天將小鼠隨機分為兩組:PBS組和rMBP－NAP組。PBS組每只注射0.2 ml PBS，rMBPNAP 組每只注射0.2 ml的50 μg rMBP －NAP，連續治療7 d，期間每天稱量小鼠體質量并用游標卡尺測量腫瘤的長(L)和寬(D)，利用公式V=0.5×L×D2計算腫瘤體積。

1.2.2 絲裂霉素C處理H22腫瘤細胞 將H22腫瘤細胞與絲裂霉素C(終濃度為10 μg/ml)于37℃，5%CO2培養箱中共培養。2 h后，移去培養基，PBS洗3次，加入新鮮RPMI－1640培養基，繼續培養。

1.2.3 ELISA 檢測 IL－12/IL－23抗體阻斷后脾細胞中的IFN－γ 荷瘤小鼠模型建立如1.2.1所述，模型期間，荷瘤小鼠不進行給藥處理，荷瘤后第8天即處死小鼠，無菌條件下取出脾臟，制成單個脾細胞懸液，調整細胞濃度為1×107個/ml。以2×106個/孔鋪于兩個24孔板中，同時按10∶1的比例加入相應數量MMC處理的H22腫瘤細胞。向上述脾細胞中每孔同時加入100 μg/ml rMBP－NAP和抗體 anti－IL－12(10 μg/ml)/anti－ IL －23(500 ng/ml)/Goat IgG control，即分為4組，IL－12阻斷組，IL－23阻斷組，IgG同型對照組以及空白對照組(PBS代替rMBP－NAP且無抗體處理)，分別于抗體加入后3 d和7 d(于第3天每孔加入100 U/ml的重組人IL－2繼續培養)，收集培養上清，ELISA法檢測培養上清中的IFN－γ。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，定量資料采用均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 rMBP－NAP抑制肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長 荷瘤3 d后，rMBP－NAP組和PBS組小鼠均出現腫瘤，但rMBP－NAP組腫瘤體積小于PBS組。荷瘤后4～7 d，相對于PBS組，rMBP－NAP組小鼠腫瘤體積增長顯著減緩(P＜0.05)。第8天犧牲小鼠，稱量并比較瘤重，結果顯示rMBP－NAP組腫瘤質量顯著低于PBS組(P＜0.01)。見圖1。

圖1 rMBP－NAP抑制H22荷瘤小鼠腫瘤生長

2.2 IL－12和IL－23抗體阻斷顯著降低IFN－γ的分泌 培養3 d后，對各組脾細胞培養上清中的IFN－γ表達量進行檢測，結果顯示，與空白對照組相比，rMBP－NAP促進脾細胞分泌大量的IFN－γ。加入anti－IL－12抗體，rMBP－NAP不能有效誘導IFN－γ分泌，低于檢測下限。加入 anti－IL－23抗體后，IFN－γ濃度為500 pg/ml，與同型對照抗體組相比，呈極顯著性下降。培養7 d后，收集上清并檢測IFN－γ表達量，anti－IL－12抗體組(20 pg/ml)和anti－IL－23抗體組(1 000 μg/ml)IFN－γ的表達量仍顯著低于同型對照抗體組(1 600 μg/ml)。見圖2。

圖2 IL－12和IL－23抗體阻斷對IFN－γ表達的影響

3 討論

IL－12是一種促炎性細胞因子，IL－12能夠直接作用于T細胞和NK細胞等，增強Th1型免疫反應、細胞毒性T細胞(CTL)反應及NK殺傷作用，對于腫瘤細胞的清除具有重要作用，因此，IL－12被普遍認為是一種強有力的抗腫瘤相關細胞因子。IL－23同屬于IL－12家族成員，與IL－12表現出一定的功能相似性，IL－23在抗腫瘤免疫中的作用也逐漸受到人們的關注[9]。HP－NAP被證實能夠有效地誘導中性粒細胞和單核細胞表達IL－12和IL－23細胞因子，具有抗腫瘤作用的潛力。實驗結果顯示，rMBP－NAP能夠顯著抑制H22荷瘤小鼠腫瘤的生長，瘤體積明顯減小，瘤重明顯減輕。荷瘤小鼠脾細胞體外以rMBPNAP刺激且分別用IL－12或IL－23抗體阻斷。3 d后收集脾細胞培養上清，anti－12抗體處理組檢測不到IFN－γ表達，anti－23抗體處理組IFN－γ濃度顯著下降(500 pg/ml)。處理7 d后，anti－12抗體組和anti－23與同型對照組相比差異有統計學意義。結果提示，IFN－γ介導的rMBP－NAP的抗腫瘤作用主要依賴于IL－12，且IL－23與IL－12協同作用進一步提升IFN－γ的表達，起到增強抗腫瘤的作用。已有研究證實，在小鼠腫瘤模型中，IL－12和IL－23聯合作用能夠起到更好的抗腫瘤效果。加入IL－23能夠顯著增強IL－12的抗腫瘤作用。而IL－23發揮抗腫瘤作用，依賴于機體內源性IL－12[10]。這提示IL－12和IL－23可能通過相互影響、相互促進的方式協同促進IFN－γ表達，從而發揮抗腫瘤作用。本研究對rMBP－NAP在H22荷瘤小鼠模型中的抗腫瘤作用及IL－12/IL－23軸在其中扮演的角色進行了初步的研究，為rMBP－NAP的抗腫瘤治療應用提供了一定的理論基礎。

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