EGCG聯合順鉑對乏氧人肺腺癌A549細胞凋亡的促進作用

李芳 黃瓅 蘇曉麗 胡成平

(1.鄭州大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科 河南鄭州 450052;2.中南大學湘雅醫院呼吸與危重癥醫學科 湖南長沙 410008)

以順鉑為基礎的聯合化學治療是晚期肺腺癌，尤其是EGFR基因無突變患者的主要治療手段[1]。然而，由于腫瘤細胞耐藥性的出現及鉑類的副作用致患者無法耐受，需停藥或減量等，常導致化療失敗，產生治療瓶頸。近年來多項研究表明，實體性腫瘤乏氧微環境是腫瘤放、化療抵抗的重要因素[2－3]。綠茶是世界上僅次于水的第二大飲料，含有大量的多酚化合物，以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin－3－gallate，EGCG)含量最高。既往研究顯示，常氧條件下EGCG可增強鼻咽癌細胞或前列腺癌細胞對順鉑或多西他賽的化療敏感性[4－5]。但EGCG對乏氧條件下腫瘤細胞化療敏感性的影響及其機制的報道較少。因此，本實驗選取人肺腺癌A549細胞為研究對象，采用氯化鈷(CoCl2)建立A549細胞體外化學乏氧模型，觀察EGCG聯合順鉑對乏氧人肺腺癌A549細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細胞株 人肺腺癌A549細胞株(中南大學湘雅醫學院細胞中心)，氯化鈷(CoCl2)，EGCG(美國Sigma公司)，DMEM培養基(Gibico公司)，熱滅活胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，溴化二甲基噻唑爾本四氮唑(MTT)(美國AMRESLO公司)，二甲基亞砜(DMSO)(北京鼎國生物技術有限公司)，AnnexinV－FITC/PI雙染試劑盒、細胞凋亡－Hoechst染色試劑盒(上海碧云天公司)，注射用順鉑10 mg/瓶(凍干型)(山東齊魯制藥廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 A549細胞實驗分組 A549細胞于10%胎牛血清的DMEM培養液中，置37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度的細胞培養箱(美國Forma Scientific公司)中培養，80%匯合時換無血清培養液繼續培養24 h，使其同步化后，吸棄原培養液，加入含終濃度0、200 μmol/L CoCl2[6]的10%胎牛血清的 DMEM培養液。其中0 μmol/L CoCl2為常氧組;200 μmol/L CoCl2為乏氧組;200 μmol/L CoCl2乏氧的同時，加入 EGCG為EGCG組。

1.2.2 MTT檢測EGCG單獨或聯合順鉑對乏氧A549細胞生長的抑制作用 A549細胞生長培養至對數生長期時，調整細胞濃度為1.5×105/ml，接種至96孔培養板上，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細胞培養箱中培養24 h同步化后，吸棄培養基，實驗分為常氧組、乏氧組及EGCG組，培養24 h后，加入順鉑繼續培養24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續培養4 h，加入150 μl DMSO，振蕩10 min后經酶聯免疫檢測儀(美國Bio－Rad公司)測A570值。各組同時設置空白調零孔，不接種任何細胞，余同各組，以上各組細胞每組設4個復孔。按以下公式分別計算各組細胞的抑制率，并利用直線加權回歸方程計算A549細胞EGCG、順鉑的半效抑制濃度(IC50)。A549細胞存活率 (%)=(OD實驗組－ OD空白調零孔)/(OD對照組－OD空白調零孔)×100%;A549細胞生長抑制率(%)=1－細胞存活率(%)。

1.2.3 光鏡下Hoechst染色法觀察EGCG單獨或聯合順鉑對乏氧A549細胞核形態的影響 根據1.2.2實驗結果，選取EGCG最佳干預濃度。3組A549細胞分別接種于含載玻片的6孔板中培養24 h后，加入順鉑，使其濃度為0、10 μmol/L，繼續培養 24 h 后，按照Hoechst細胞凋亡檢測試劑盒說明，加入0.5 ml Hoechst 33258染液，熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察各組A549細胞核的形態。

1.2.4 AnnexinV －FITC/PI雙染法檢測 EGCG 單獨或聯合順鉑對乏氧A549細胞凋亡的影響 A549細胞生長培養至對數生長期時，調整A549細胞濃度為2×106/ml。然后，每孔 1.5 ml(3 ×106/孔)接種于 6孔板中，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細胞培養箱中培養24 h使其同步化后，實驗分為常氧組，乏氧組及EGCG組，培養24 h后，加入順鉑，使其濃度為0、10 μmol/L，繼續培養24 h后，按照 AnnexinV －FITC/PI雙染法使用說明書進行操作。AnnexinV－FITC/PI雙染法結果分析:雙變量流式細胞儀(美國Beckman公司)的散點圖上的左上象限(R2):標記為AnnexinV－FITC(－)/PI(+)，代表損傷細胞;左下象限(R4):標記為Annexin V－FITC(－)/PI(－)，代表存活細胞;右上象限(R3):標記為AnnexinV－FITC(+)/PI(+)，代表晚期凋亡細胞和或壞死細胞;右下象限(R5):標記為AnnexinV－FITC(+)/PI(－)，代表早期凋亡細胞。

1.3 統計學方法 數據錄入SPSS 16.0統計軟件，定量資料采用均數±標準差(±s)表示，多個組之間的均數比較采用One way ANOVA，組間兩兩比較用LSD檢驗。每個實驗重復3次，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT檢測化學乏氧條件下EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞生長抑制的影響 A549細胞200 μmol/L CoCl2化學乏氧培養的同時，加入EGCG，使其終濃度分別為 0、25、50、100、150、200 mg/L，37℃、飽和濕度、50 ml/L CO2的細胞培養箱中培養48 h后，MTT檢測結果示:以50 mg/L EGCG為拐點，A549細胞生長抑制程度呈EGCG濃度依賴性的增加(圖1)。為避免高濃度EGCG引起A549細胞顯著抑制進而影響順鉑IC50的檢測，下述實驗EGCG組均選擇50 mg/L EGCG為實驗濃度。3組細胞培養24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為 0、10、20、40、80、160 μmol/L。培養 24 h后，MTT結果示常氧組及EGCG組A549細胞在相同濃度順鉑作用下的抑制率均較乏氧組升高，進一步根據A549細胞生長抑制率計算A549細胞順鉑IC50，結果示常氧組及EGCG組順鉑IC50均較乏氧組順鉑降低。見表1。

圖1 EGCG對乏氧人肺A549細胞生長、增殖的影響

2.2 Hoechst染色法觀察化學乏氧條件下EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞核形態的影響 3組A549細胞培養24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為0、10 μmol/L，繼續培養 24 h 后，Hoechst染色法觀察A549細胞形態，結果示0 μmol/L順鉑作用時，常氧組及乏氧組A549細胞核呈藍色，形態規則，染色質顆粒均勻分布于細胞核內，EGCG組A549細胞部分細胞核呈亮藍色，形態不規則，染色質固縮、致密濃染;10 μmol/L順鉑作用時，3組A549細胞部分細胞核均成呈亮藍色，形態不規則，染色質固縮、致密濃染，提示為凋亡細胞(△)，見圖2。

表1 EGCG對A549細胞順鉑IC50的影響(±s)

表1 EGCG對A549細胞順鉑IC50的影響(±s)

組別A549細胞生長抑制率順鉑10 μmol/L 順鉑20 μmol/L 順鉑40 μmol/L 順鉑80 μmol/L 順鉑160 μmol/L 順鉑IC50/(μmol/L)常氧組 0.35 ±0.05 0.46 ±0.07 0.62 ±0.04 0.76 ±0.03 0.91 ±0.01 30.97 ±2.86乏氧組 0.17 ±0.11 0.25 ±0.10 0.34 ±0.11 0.48 ±0.13 0.70 ±0.04 107.01 ±10.19 EGCG 組 0.26 ±0.15 0.35 ±0.05 0.48 ±0.08 0.63 ±0.06 0.82 ±0.05 41.28 ±3.85

圖2 EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞核形態的影響

2.3 AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測化學乏氧條件下EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞凋亡的影響3組A549細胞培養24 h后，加入順鉑，使其終濃度分別為 0、10 μmol/L，繼續培養 24 h 后，AnnexinV －FITC/PI雙染法檢測各組A549細胞的凋亡率(圖3)，結果示0 μmol/L順鉑作用時，EGCG組A549細胞凋亡率較乏氧組及常氧組均升高(P＜0.05);當與10 μmol/L順鉑聯合作用時，常氧組及EGCG組A549細胞凋亡率均較乏氧組A549細胞升高(P＜0.05)。見表2。

圖3 AnnexinV－FITC/PI雙染法檢測A549細胞的凋亡率

表2 EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞凋亡率的影響(±s)

表2 EGCG單獨或聯合順鉑對A549細胞凋亡率的影響(±s)

順鉑0 μ 順鉑10 μ項目/%常氧組 137 980±17 161 0.38±0.12 109 873±8 679 15.88±2 mol/L R2+R3+R4+R5 R3+R5/%mol/L R2+R3+R4+R5 R3+R5.31乏氧組 124 407±10 574 0.41±0.14 122 783±11 173 8.12±0.67 EGCG 組 135 671±9 833 3.15± 0.28 117 714±10 142 13.28±0.11

3 討論

實體性腫瘤如肺癌、肝癌等常呈失控性生長，導致瘤內低氧。研究表明幾乎所有的實體腫瘤中均有乏氧細胞存在[7]，距離功能性血管100～150 μm處即可發生[8]，不僅促使腫瘤發生惡性轉化及轉移[9－10]，而且是導致腫瘤細胞化、放療耐藥的始動因素[2－3]。本實驗選取人肺腺癌A549細胞為研究對象，采用 CoCl2建立A549細胞體外化學乏氧模型，發現乏氧組A549細胞凋亡率較常氧組無明顯增加，與Karovic等[11]研究相似，但是其順鉑 IC50較常氧組增高，說明低濃度(≤200 μmol/L)CoCl2化學乏氧對細胞的毒性作用很弱，但可以誘導A549細胞順鉑耐藥。

綠茶是我國產量最多的茶類，又稱不發酵茶。與烏龍茶等發酵茶相比，綠茶以茶樹新梢作為原料，經殺青、揉捻、干燥等工藝制成，較多地保留了新鮮茶葉內的天然物質如咖啡堿、脂多糖、茶多酚等。EGCG是從綠茶中提取得到的兒茶素類單體，是綠茶提取物中活性成分茶多酚的主要構成部分。流行病學調查及實驗室研究顯示，飲用綠茶或給予EGCG治療能使女性患腫瘤的時間推遲 7.3 a，男性推遲 3.2 a[12]，并且防止乳腺癌轉移和復發[13]。本課題組長期致力于EGCG的防癌機制研究[14－16]。前期，本課題組顧其華等[14]發現給予大鼠200 mg/L EGCG可以通過上調p53及下調Bcl－2的表達，明顯降低大鼠3，4－苯并芘肺內注射肺癌成瘤率。游佳等[16]發現EGCG能夠有效糾正非小細胞肺癌患者淋巴細胞中Th1/Th2的異常漂移，有助于以細胞免疫為主的抗腫瘤免疫能力的恢復。除防癌、抗癌之外，其他學者發現常氧條件下EGCG可明顯增強膽管癌細胞或耐順鉑A549細胞對吉西他濱或順鉑的化療敏感性[4－5]。但是，有關 EGCG能否增加乏氧條件下腫瘤細胞化療敏感性的研究較少。

為探討EGCG能否增加乏氧條件下A549細胞順鉑化療敏感性，本實驗于200 μmol/L CoCl2化學乏氧條件下，給予不同濃度的EGCG或順鉑作用A549細胞，MTT檢測結果示乏氧條件下A549細胞以50 mg/L EGCG為拐點，呈EGCG濃度依賴性的生長抑制。當50 mg/L EGCG與順鉑聯合后，EGCG組A549細胞在相同濃度順鉑作用下的存活率及順鉑IC50均較CoCl2組明顯降低，提示EGCG聯合順鉑能夠增強乏氧條件下A549細胞的生長抑制作用。順鉑是肺癌及其他實體瘤如胃癌、乳腺癌等治療中使用最廣泛的鉑類藥物。通過與DNA形成復合物，抑制DNA復制，進一步通過下調BCl－2表達誘導細胞凋亡[17]。除去抗腫瘤作用以外，順鉑對人體常造成脫發，并產生骨髓抑制、消化道反應、神經毒性等副作用，嚴重影響患者的心理健康及生活質量，甚至危及患者生命安全，由此常導致順鉑臨床治療受限，降低化療有效率及影響患者預后。本研究通過Hoechst染色，熒光顯微鏡下觀察A549細胞的形態，結果發現EGCG組及各組加入順鉑后，部分A549細胞核呈亮藍色，形態不規則，染色質固縮、致密濃染出現，提示乏氧條件下，EGCG及順鉑均可誘導A549細胞凋亡。本實驗進一步通過AnnexinVFITC/PI雙染流式細胞儀檢測EGCG組單獨或聯合順鉑對化學乏氧條件下A549細胞凋亡率的影響，結果示EGCG組凋亡率較乏氧組增加;與順鉑聯合作用時，EGCG組A549細胞凋亡率較乏氧組顯著增加。

綜上所述，本研究給予低劑量的EGCG聯合順鉑對乏氧人肺腺癌A549細胞的凋亡起促進作用。因此，順鉑化療的同時給予EGCG，不僅能夠增強順鉑誘導腫瘤細胞凋亡的作用，對于順鉑耐受較差或需減量的患者，通過減少順鉑劑量，降低高劑量順鉑造成的毒性作用，以期增加耐受性和依從性，明顯改善患者的生活質量及預后。

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