核糖體蛋白L37在前列腺癌中的表達及臨床意義

盛鑌，張蒙，馬鵬德，楊闊，徐勇，王玉琢

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

核糖體蛋白L37在前列腺癌中的表達及臨床意義

盛鑌，張蒙，馬鵬德，楊闊，徐勇，王玉琢

（天津醫科大學第二醫院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

目的：研究人核糖體蛋白L37（RPL37）在前列腺癌中的表達及其臨床意義。方法：應用real-time qPCR（RT-qPCR）和Western blot檢測64例前列腺癌組織及癌旁組織中RPL37 mRNA和蛋白的表達情況，分析其與前列腺癌患者臨床病理特征及生存狀況之間的關系。結果：RT-qPCR和Western blot結果表明，前列腺癌組織中RPL37 mRNA和蛋白表達水平明顯高于癌旁組織（P＜0.05）；RPL37 mRNA的表達增高與患者血清中的前列腺特異性抗原（PSA）水平增加、高Gleason評分及腫瘤的臨床分期有關（P＜0.05），與患者的年齡、淋巴結轉移、精囊侵犯及手術切緣無關（P＞0.05）。生存分析表明，前列腺癌患者中RPL37 mRNA高表達組的總生存期顯著低于低表達組（P=0.006）。結論：RPL37 mRNA的表達增高與前列腺癌的發生、發展相關；RPL37可以初步判斷前列腺癌患者的預后。

RPL37；前列腺癌；RT-qPCR；預后

前列腺癌是歐美國家中老年男性最常見的惡性腫瘤之一［1］。近年來，我國前列腺癌發病率也在不斷增加［2］，嚴重威脅男性健康。探討前列腺癌的發病機制，將為前列腺癌的臨床治療提供新的思路。核糖體蛋白L37（RPL37）是核糖體蛋白大亞基的組成成分之一，位于5p13，編碼97個氨基酸，相對分子質量為11 070，含有多個絲/蘇氨酸磷酸化位點和一個鋅指結構區域［3］。消減雜交技術研究發現，RPL37在結腸癌組織和前列腺癌組織中表達增高，這提示RPL37可能參與癌癥的發生發展［4-5］。因此，本研究就RPL37在前列腺癌組織中的表達進一步分析，并探討其與臨床特征、預后之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例與標本收集天津醫科大學第二醫院泌尿外科2010年6月-2012年8月手術切除的64例前列腺癌組織，以及距離腫瘤邊緣2 cm以上的癌旁正常前列腺組織，組織標本由我院病理科經HE染色明確診斷。患者年齡43～75歲，中位年齡62歲，其中＜62歲者26例，≥62歲者38例；外周血PSA＜10 ng/mL者25例，≥10 ng/mL者39例；Gleason評分＜7者25例，等于7者19例，＞7者20例；臨床分期T1者35例，T2和T3者29例；淋巴結轉移陰性者40例，陽性者24例；精囊侵襲陰性者43例，陽性者21例；手術切緣陰性者33例，陽性者31例。所有患者術前均未行放、化療以及內分泌治療，標本術后立即取材，并放于-80℃保存，供RT-qPCR 和Western blot檢測。

1.2 試劑Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒（Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit）購自Thermo公司，RT-qPCR試劑盒（Fast Start SYBR Green Master）購自Roche公司，引物由蘇州金唯智公司合成。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司，所需抗體均購自Affinity Bioscience公司，ECL發光液購自Advansta公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取及逆轉錄將組織標本用Trizol法提取總RNA，以紫外分光光度儀檢測RNA的濃度和純度，各組吸光度A260/A280均接近2.0，RNA經甲醛變形凝膠電泳證實為完整。采用Thermo公司Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，在20 μL反應體系中將RNA逆轉錄成cDNA，產物置于-20℃保存。

1.3.2 RT-qPCR實時定量PCR反應在7900HT Fast Real-Time PCR System上操作，采用Roche公司Fast Start SYBR Green Master試劑，引物序列見表1，反應條件為：94℃3 min，然后94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min共40個循環，最后72℃延伸5 min。基因的相對表達水平通過相對定量法（2-△△Ct）進行分析。每次實驗重復3次。

表1 引物序列及擴增長度Tab 1Primer sequence and amplicon size

1.3.3 Western blot提取前列腺癌組織和正常癌旁組織總蛋白應用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，按照每孔50 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳，冰浴電轉至硝酸纖維素膜上，5％的脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗孵育4℃過夜（RPL37 1∶1 000，GAPDH 1∶3 000），室溫下二抗孵育1 h（羊抗兔1∶5 000），TBST洗膜3次，ECL發光系統曝光檢測。

1.4 統計學處理不同組間的RPL37 mRNA表達水平采用t檢驗分析，結果通過±s顯示；RPL37 mRNA表達和臨床指標通過秩和檢驗分析；生存分析用Kalpan-Meier曲線估計，Log-rank檢驗。所有分析均借助SPSS20.0統計軟件，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌中的表達 RT-qPCR和Western blot檢測表明，前列腺癌組織中RPL37 mRNA和蛋白的表達明顯高于癌旁組織（圖1，P=0.037）。

圖1 RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌組織和正常癌旁組織中的表達Fig 1The expression of RPL37 mRNA and protein in prostate cancer tissues and noncancerous tissues

2.2 RPL37 mRNA表達與前列腺癌患者臨床指標的關系根據RPL37 mRNA的中位表達水平，將前列腺癌患者分為兩組，其表達水平高于中位水平為高表達組（34例），低于中位水平為低表達組（30例）。臨床指標分析顯示，RPL37 mRNA的高表達與前列腺癌患者術前前列腺特異性抗原（PSA）水平升高、Gleason評分及臨床分期增加有關，與其他臨床病理特征如年齡、淋巴結轉移、精囊侵襲及手術切緣無相關性（表2）。

表2 前列腺癌組織中RPL37 mRNA表達水平與臨床指標的關系（n）Tab 2Relation between RPL37 expression and clinical characteristics in prostate cancer tissues（n）

2.3 RPL37 mRNA表達與前列腺癌患者生存時間的關系RPL37 mRNA高表達患者中術后5年內死亡47.1％（16例），生存5年以上者52.9％（18例）；低表達患者中術后5年內死亡20.0％（6例），生存5年以上者80.0％（24例），各組間比較具有顯著性差異（P=0.006Logrank檢驗）（圖2）。

圖2 前列腺癌患者中RPL37 mRNA表達與生存時間分析Fig 2Association of RPL37 mRNA expression with cum survival of prostate cancer patients

3 討論

核糖體蛋白是核糖體的重要組成部分，在細胞內蛋白質的合成中發揮重要作用。近年來，越來越多的證據表明，核糖體蛋白還具有核糖體外功能，參與復制、轉錄、DNA修復、翻譯調控及正常細胞的惡性轉化等［6］。很多研究發現，腫瘤組織中的核糖體蛋白表達出現改變［7-11］。Vaarala等［4］用消減雜交技術發現，RPL37在前列腺癌細胞LNCaP中的表達水平是正常前列腺細胞PrEC的3.4倍，通過原位雜交技術進一步證實RPL37在前列腺癌組織中表達增加。因此RPL37在前列腺癌的發生發展中可能發揮重要作用。

很多研究報道了關于核糖體蛋白基因的過表達在腫瘤中的作用機制，但RPL37基因高表達在前列腺癌的作用機制目前還不清楚。通過文獻復習發現，核糖體蛋白異常表達可能通過以下機制促進腫瘤的發生發展。首先，Sturgill等證實核糖體S6蛋白激酶（RSK）可以激活絲/蘇氨酸磷酸化位點使S6蛋白發生磷酸化，從而促進mRNA的翻譯，在調節細胞生長和增殖過程中起重要作用［12］；核糖體蛋白的鋅指結構能夠與核酸（DNA和RNA）結合，這種結合可能使核糖體蛋白干擾細胞內轉錄和翻譯過程，從而導致細胞惡性轉變［13］。而Barnard等［3］研究發現RPL37同時含有多個絲/蘇氨酸磷酸化位點和一個鋅指結構區域。因此，RPL37也可能通過上述作用機制促進腫瘤的發生。其次，大約50％的人類腫瘤中，p53活性喪失或突變［14］。Loging等［15］研究表明，R248W p53突變的結腸癌細胞和何杰金氏淋巴瘤的細胞系中RPL37 mRNA的表達水平增高，這些結果顯示p53發生突變時，核糖體蛋白基因表達增高可能是在人類腫瘤中過表達的一種機制。最后，核糖體蛋白基因過表達時具有抗凋亡作用。研究發現，L7、S11及L35a高表達時均導致了腫瘤細胞凋亡抑制的發生［16-17］。在結腸癌細胞系中發現，核糖體蛋白基因的過表達抑制了腫瘤細胞的凋亡，且RPL37的表達在結腸癌組織中明顯增高，因此，RPL37的高表達可能通過抗凋亡作用導致結腸癌的發生。

本研究通過RT-qPCR和Western blot檢測RPL37 mRNA和蛋白在前列腺癌組織以及癌旁組織中的表達，結果表明，RPL37 mRNA及蛋白在前列腺癌組織中的表達明顯增高，且與其癌旁組織相比，差異具有統計學意義，此結果與前人研究相符。本研究同時對RPL37 mRNA的表達量與前列腺癌臨床病理特征進行相關性分析，結果顯示隨著PSA水平、臨床分期和Gleason評分的增加，RPL37 mRNA的表達量隨之增加，差異均具有顯著性，但是與患者年齡、有無淋巴結轉移、精囊侵襲及手術切緣無相關性。隨后筆者對RPL37 mRNA的表達情況與患者的5年生存率進行分析發現，高表達RPL37 mRNA的患者的5年生存時間明顯比低表達組低，說明RPL37基因的高表達降低了前列腺癌患者術后的生存時間。

總之，RPL37在前列腺癌中高表達，與前列腺癌的臨床特征具有一定的相關性，且在前列腺癌患者的預后預測中具有潛在的指導價值。由于病例數有限，可能會影響分析的可靠性，有待于積累更多的病例再行進一步的分析。有關RPL37在前列腺癌發生發展中的作用機制目前還不明確，需要進一步后續實驗進行深入研究。

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（2015-03-30收稿）

Expression of ribosomal protein L37 in prostate cancer and its clinical significance

SHENG Bin，ZHANG Meng，MA Peng-de，YANG Kuo，XU Yong，WANG Yu-zhuo
（Department of Urology，The Second Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin Institute of Urology，Tianjin 300211，China）

Objective：To explore the expression of ribosomal protein L37 in prostate cancer and its clinical significance.Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction（RT-qPCR）and Western blot were used to measure and compare the levels of the expression of ribosomal protein L37 mRNA and protein in 64 specimens from prostate cancer tissues and surrounding non-tumor tissues. The relationship between RPL37 mRNA expression and clinicopathological factors were statistically analyzed.Results:RPL37 mRNA and protein expression were expressed at higher levels in prostate cancer tissues compared with non-tumor tissues（P＜0.05）.The enhanced expression of RPL37 mRNA was significantly associated with the increased level of PSA，higher Gleason score and clinical stage，but not correlated with age，lymph nodemetastasis，seminal vesicle invasion and surgical margin status.Survival analysis showed that prostate cancer patients with high expression of RPL37 had shorter survival time than those with low RPL37 expression.Conclusion:The elevated expression of RPL37 may be involved in the development of prostate cancer and related to poor survival of prostate cancer patients.

RPL37；prostate cancer；RT-qPCR；prognosis

R737.25

A

1006-8147（2015）05-0401-03

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃（12JCYBJC31400）

盛鑌（1989-），男，碩士在讀，研究方向：泌尿外科；通信作者：王玉琢，E-mail：ywang1407@126.com。