體外表達(dá)GLP-1多拷貝的最優(yōu)條件研究

林松峰，張瑞，王丹丹，郭剛

（1.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，天津 300070；2.協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津 300384；3.天津長和生物技術(shù)有限公司，天津 301925）

體外表達(dá)GLP-1多拷貝的最優(yōu)條件研究

林松峰1，3，張瑞1，王丹丹2，郭剛1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，天津 300070；2.協(xié)和干細(xì)胞基因工程有限公司，天津 300384；3.天津長和生物技術(shù)有限公司，天津 301925）

目的：探討胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的序列拷貝數(shù)及拷貝溫度、時(shí)間與其體外表達(dá)水平的關(guān)系。方法：首先將以4拷貝數(shù)為單位的GLP-1序列插入到pET-22b（+）中構(gòu)建GLP-1多拷貝表達(dá)載體，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行蛋白體外培養(yǎng)表達(dá)。取不同溫度和誘導(dǎo)時(shí)間段進(jìn)行蛋白表達(dá)，檢測GLP-1在不同條件下的蛋白表達(dá)量，優(yōu)化蛋白最適表達(dá)條件。結(jié)果：GLP-1多拷貝在BL21菌株中的最佳表達(dá)溫度為26℃，最適誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。拷貝數(shù)與GLP多拷貝表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，拷貝數(shù)越多，蛋白產(chǎn)量越低。結(jié)論：GLP多拷貝最佳體外表達(dá)條件為4拷貝，26℃培養(yǎng)IPTG誘導(dǎo)8 h。

GLP-1；多聚體；基因表達(dá)

胰高血糖素樣肽（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）是一種由哺乳動(dòng)物腸道L細(xì)胞分泌的一種由31個(gè)氨基酸所組成的多肽類激素，可以促進(jìn)高血糖狀態(tài)下胰島素的分泌［1-2］。促進(jìn)胰島分泌的研究要追溯到100年前，Moore等［3］用來自十二指腸的一種分泌物治療糖尿病。人們發(fā)現(xiàn)小腸L細(xì)胞能夠分泌很多促進(jìn)胰腺分泌的因子，無論是口服還是注射葡萄糖都能誘導(dǎo)胰島素的分泌，故而分泌物又稱為腸促胰島素［4］。GLP-1是近來研究最多的一種新型促胰島素合成的因子，GLP-1與細(xì)胞表面受體結(jié)合后可以激活胰島素信號(hào)通路中的一系列基因轉(zhuǎn)錄。從而促進(jìn)cAMP水平升高，增加胰島素合成［5-8］。GLP-1屬于胰高血糖素原基因的翻譯后組織特異性蛋白水解產(chǎn)物，進(jìn)食可引起腸L細(xì)胞釋放GLP-1，產(chǎn)生葡萄糖濃度依賴性促胰島素分泌效應(yīng)。近來研究發(fā)現(xiàn)：GLP-1對(duì)機(jī)體多種組織和器官，尤其是胰島具有諸多功能調(diào)節(jié)效應(yīng)［9-10］。但GLP-1體內(nèi)半衰期不足2 min，活性肽可被二肽基肽酶迅速降解，從而限制了其生物活性的發(fā)揮。所以優(yōu)化GLP-1結(jié)構(gòu)就變得無比重要。利用串聯(lián)的方法合成多拷貝活性肽可以有效防止蛋白被肽酶降解，本實(shí)驗(yàn)通過串聯(lián)不同拷貝數(shù)的GLP-1構(gòu)建到能在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的原核表達(dá)載體pET-22b（+）中，希望能夠得到能防止或抵抗二肽基肽酶降解的串聯(lián)GLP-1肽，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，提高多拷貝肽的表達(dá)量。

1 材料與方法

1.1 材料大腸桿菌BL21（DE3），質(zhì)粒載體：pET-22b（+）均購自Novagen（美國）公司；將GLP-n-拷貝數(shù)序列插入克隆質(zhì)粒pMD，自行構(gòu)建pMD-GLP-n；IPTG購自Sigma（美國）公司；限制性內(nèi)切酶以及修飾酶購自TAKARA生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 克隆載體的構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)：GLP-1 cDNA序列，由NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫檢索獲得。序列號(hào)：FW565320.1。序列為：

擴(kuò)增引物由生物學(xué)軟件Primer premier 6.0設(shè)計(jì)，5′和3′引物兩端分別引入SalI和XhoI酶切位點(diǎn)。為避免GLP-1α-螺旋間的空間位阻影響，本實(shí)驗(yàn)在GLP-1中7-36AA結(jié)構(gòu)域間引入了4個(gè)甘氨酸。

其中單線部分為SalI和XhoI酶切位點(diǎn)，雙線部分為甘氨酸序列，斜體部分為引物，加粗部位為酶切位點(diǎn)。SalI和XhoI為同尾酶，所以分別經(jīng)SalI 和XhoI酶切后DNA片段粘性末端可相互連接，連接后序列則無法重新被SalI或XhoI酶識(shí)別切割。經(jīng)PCR和相應(yīng)酶切連接分別獲得2、4、8、16多拷貝GLP-1編碼序列。

（2）EcoRI或SmaI酶切位點(diǎn)引入：EcoRI或SmaI酶切位點(diǎn)的引入方法同上。該酶切位點(diǎn)的引入是為了將目的片段插入到克隆載體pMD-18T中。

正向引物:5′GAA TTC CAC GCC GAG GG 3′反向引物:5′CCC GGG TCA TCC TCT TCC 3′1.2.2表達(dá)載體的構(gòu)建蛋白表達(dá)載體示意圖見圖1。提取pMD-18T-（GLP-1）n質(zhì)粒，用Bam HI和Hinc II酶切得到多拷貝GLP-1串聯(lián)序列。然后用Sal I將表達(dá)載體pET-22b（+）線性化，pfuDNA聚合酶將各自的粘性末端補(bǔ)平，再以Bam HI對(duì)上述得到平末端片段進(jìn)行酶切，利用T4連接酶連接到pET-22b（+）的開放閱讀框內(nèi)。連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)得到陽性轉(zhuǎn)化子，送生工測序，驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。采用CaCl2轉(zhuǎn)化法制備感受態(tài)細(xì)胞。50 mL對(duì)數(shù)生長期BL21（OD600=0.6）5 000 r/min離心5 min，預(yù)冷ddH2O重懸2次，去除上清。10mL0.1mol/L CaCl2重懸菌體，離心去上清。取2 mL 0.1 mol/L CaCl2懸浮沉淀，冰上分裝感受態(tài)細(xì)胞。500 ng連接產(chǎn)物與150 μ L新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞混合后，熱擊法轉(zhuǎn)化，用pET-22b（+）質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。

圖1 表達(dá)載體pET-22b-（GLP-1）n的構(gòu)建示意圖Fig 1The construction scheme of expression vector pET-22b-（GLP-1）n

1.2.3 多拷貝GLP-1的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化從1.2.2測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子中劃線挑取單克隆，接種于10 mL含100 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，230 r/min 37℃培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到0.6。將對(duì)數(shù)生長期的菌液按1：20接種到新鮮LB培養(yǎng)基中，230 r/min分別孵育培養(yǎng)于26℃和37℃直至菌液OD600達(dá)到0.6。加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4 mmol/L。從加入誘導(dǎo)物開始計(jì)時(shí)，每隔2 h取樣直至12 h。菌液立即在4℃，12 000 r/min條件下離心10 min，-80℃保存上清蛋白溶液和菌體。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)蛋白的提取和濃縮用1×PBS（pH 7.2）洗滌菌體離心后重懸，-80℃反復(fù)凍融2～3次后超聲破碎。超聲破碎條件設(shè)定為：150 W，30 s/次，冰浴間隔60 s，600次。裂解液4℃，5 000 r/min離心20 min，收集上清（含可溶性蛋白）和沉淀（包涵體及細(xì)胞碎片）。將獲得的蛋白上清液再次離心，4℃，12 000 r/min，10 min，再次收集上清（可溶性蛋白）和沉淀（包涵體）以備表達(dá)蛋白的檢測。取不同誘導(dǎo)條件的樣品上清液，4℃，12 000 r/min再次離心10 min去雜。上清液采用甲醇和氯仿抽提法濃縮蛋白。

1.2.5 多拷貝GLP-1的表達(dá)檢測SDS-PAGE電泳檢測1.2.4中得到的上清液和沉淀，鑒定目的蛋白的表達(dá)情況。分別取樣，上清液加入等體積的2×上樣緩沖液（2％SDS，5％巰基乙醇，10％甘油，2％溴酚藍(lán)，0.01 mTris-HCl（pH8.0）），沉淀直接加入1×上樣緩沖液溶解。兩種樣品100℃沸水浴5 min使蛋白充分變性，取出待上樣液恢復(fù)至常溫后上樣電泳。每孔上樣10 μL，1％SDS的Tris-HCl電泳緩沖液（pH 8.3），橫流10 mA在濃縮膠中電泳，后改為30 mA分離膠中電泳，直至指示劑電泳至距凝膠底部1 cm處左右停止電泳。

凝膠采用考馬斯亮藍(lán)法染色。固定液（50％甲醇、10％冰乙酸）固定1 h。蒸餾水洗2次，每次1 min，然后加入染色液（0.125 g考馬斯亮藍(lán)加20 mL固定液）染色1 h以上。蒸餾水洗3次，每次3 min，加入脫色液（10％冰乙酸和20％甲醇）脫色，直至條帶清晰。

2 結(jié)果

2.1 pET-22b（+）-（GLP-1）n表達(dá)載體的構(gòu)建將載體與GLP-1不同拷貝數(shù)的目的片段連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，載體在酶切和連接后開放閱讀框保持不變（圖2）。轉(zhuǎn)化子通過Amp抗性的LB固體平板篩選，得到了抗Amp抗性的轉(zhuǎn)化子。挑取單個(gè)菌落陽性轉(zhuǎn)化子37℃過夜培養(yǎng)，質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。BamHI和HindIII雙酶切驗(yàn)證，確認(rèn)多拷貝GLP-1編碼序列正確插入。質(zhì)粒酶切結(jié)果見圖3。從結(jié)果可以看出：質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，每條泳道都出現(xiàn)2條條帶。大片段都是4 500 bp左右，為pET-22b載體。小片段大小分別在2 000 bp，1 350 bp，900 bp和450 bp左右，這與GLP-1肽編碼序列16拷貝、12拷貝、8拷貝和4拷貝片段大小預(yù)測值相一致。

圖2 目的片段插入方式示意圖Fig 2The scheme of inserting style of interest ORF

圖3 表達(dá)載體BamH I&Hind III雙酶切鑒定Fig 3Electrophoresis analysis of plasmid pET-22b-（GLP-1）n expression on BamH I&Hind III digestion

2.2 溫度對(duì)GLP-1多拷貝蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)首先在37℃和26℃對(duì)GLP-1多拷貝（16拷貝、12拷貝、8拷貝和4拷貝）原核表達(dá)菌株BL21進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)16拷貝和12拷貝GLP-1表達(dá)菌株未分泌表達(dá)出目的蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色在預(yù)測大小處未發(fā)現(xiàn)目的大小蛋白條帶。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要圍繞（GLP-1）4和（GLP-1）8表達(dá)菌株蛋白表達(dá)量與培養(yǎng)溫度之間的關(guān)系進(jìn)行研究。37℃和26℃條件下IPTG誘導(dǎo)8 h菌液、上清液、細(xì)胞裂解液和包涵體沉淀分別上樣并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖4所示兩種溫度（GLP-1）4和（GLP-1）8培養(yǎng)液電泳后，26℃條件下3種樣品的目的蛋白量均高于37℃條件菌體蛋白的表達(dá)水平。所以今后的表達(dá)實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)溫度為26℃。圖中箭頭指示的是目的蛋白，（GLP-1）4蛋白條帶出現(xiàn)在16 KDa，這與預(yù)測蛋白分子量大小一致。同樣（GLP-1）8蛋白大小應(yīng)為32 KDa，SDS-PAGE電泳結(jié)果與蛋白分子量預(yù)測值一致。26℃條件下對(duì)上清液、細(xì)胞裂解液以及包涵體各部分蛋白含量對(duì)比得知細(xì)胞裂解液中含量最多，所以我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了pET-22b系列表達(dá)載體對(duì)GLP-1多拷貝的表達(dá)多集中在大腸桿菌BL21的細(xì)胞周質(zhì)中，并且蛋白以可溶形式存在。

2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GLP-1多拷貝蛋白表達(dá)的條件優(yōu)化為確定IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，我們隨后進(jìn)行了不同誘導(dǎo)時(shí)間的條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)選取表達(dá)（GLP-1）4和（GLP-1）8菌株各一株26℃條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)前的條件與2.2完全一致。待菌液培養(yǎng)至OD600=0.6加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，每2 h取一次樣。由于表達(dá)蛋白主要集中在細(xì)胞裂解液中，所以本實(shí)驗(yàn)直接處理細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。檢測結(jié)果如圖5所示，無論（GLP-1）4菌株還是（GLP-1）8菌株，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加目的蛋白的表達(dá)量逐漸升高。8 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間，目的蛋白的表達(dá)量開始減少。為更加準(zhǔn)確、直觀表示出蛋白表達(dá)量與IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的關(guān)系，我們通過灰度分析量化了兩種目的蛋白的表達(dá)量，P＜0.05，分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合上述，GLP-1多拷貝蛋白表達(dá)IPTG誘導(dǎo)最佳時(shí)間為8 h。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)目的蛋白（GLP-1）4和（GLP-1）8表達(dá)量的影響Fig 4 The effect on target protein expression at different temperatures

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)的影響Fig 5The effect target protein induction different times

3 討論

GLP-1可以刺激胰島素的分泌，抑制胰高血糖素，減緩胃排空，增強(qiáng)飽腹感，在治療糖尿病方面有著巨大的潛力。但遺憾的是GLP-1活性肽在體內(nèi)的生物半衰期很短，導(dǎo)致其在體內(nèi)生理活性難以持久發(fā)揮，因此延長GLP-1在機(jī)體內(nèi)有效的作用時(shí)間是開發(fā)該類藥物的關(guān)鍵。先前的研究發(fā)現(xiàn)促使GLP-1快速降解的原因主要是體內(nèi)二肽基肽酶能快速識(shí)別并降解單體GLP-1。目前最常用的防止GLP-1體內(nèi)快速降解的方法是開發(fā)GLP-1長效類似物［11-12］（如利那魯肽、依克那肽）和DPP-Ⅳ抑制劑［13-14］。有證據(jù)表明多拷貝串聯(lián)的方式可以增加蛋白的穩(wěn)定性［15］，如：單體蔗糖水解酶的多拷貝基因可在釀酒酵母中成功表達(dá)。而此篇研究則提供了一種以串聯(lián)體蛋白高效表達(dá)小片段基因的操作方法，該方法很可能在GLP-1類似蛋白的工業(yè)生產(chǎn)方面有相當(dāng)?shù)目衫脙r(jià)值，并對(duì)此后抗糖尿病藥物的研究做出貢獻(xiàn)。那么用這種多拷貝串聯(lián)的方法制備GLP-1類似物可能在抵抗體內(nèi)二肽基肽酶的切割起到意想不到的效果，至少可以在延緩體內(nèi)GLP-1降解時(shí)起到作用。事實(shí)上已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道證明，GLP八聚體經(jīng)胰蛋白酶消化后得到的GLP-1類似蛋白單體相比于天然GLP-1二者結(jié)構(gòu)非常相似，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，兩者都具有從Ser8-Trp25的α螺旋結(jié)構(gòu)，依然可以識(shí)別其受體。若多拷貝GLP-1用于工業(yè)生產(chǎn)，該表達(dá)方式將大大提升GLP-1蛋白的產(chǎn)率。同樣濃度的GLP-1和（GLP-1）n比較，（GLP-1）n能夠?yàn)镚LP-1受體周圍提供更高的局部濃度。因此，更低劑量的（GLP-1）n顯然更為經(jīng)濟(jì)和高效。截至發(fā)稿時(shí)，我們已經(jīng)成功構(gòu)建出新一代的GLP-1八倍串聯(lián)體的表達(dá)載體。新的表達(dá)載體將天然GLP-1（7-36AA）中的3個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行了替換，分別為Ala8-＞Ser8/ Lys26-＞Gln26/Lys34-＞Aps34，并在串聯(lián)體單體之間加入了‘PIR’氨基酸序列進(jìn)行連接。經(jīng)過氨基酸殘基替換的GLP-1八倍串聯(lián)體加入了胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，Lys26和Lys34位點(diǎn)的替換確保胰蛋白酶消化環(huán)節(jié)中GLP-1類似蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞。這種創(chuàng)新性的表達(dá)方式可能為GLP-1抵抗DPP-IV的水解以及生理功能的發(fā)揮提供一條新的途徑。

本文通過對(duì)（GLP-1）4、8、12、16多拷貝蛋白進(jìn)行表達(dá)，試圖得到不同串聯(lián)拷貝的多聚蛋白，為解決GLP-1易降解問題提供新的方法。盡管我們構(gòu)建了4種多拷貝蛋白，但只有（GLP-1）4和（GLP-1）8拷貝在BL21中得到表達(dá)。那么為什么（GLP-1）12和（GLP-1）16沒有得到表達(dá)？就大腸桿菌BL21而言，作為廣泛應(yīng)用的模式工程異源表達(dá)菌株，很多蛋白被成功表達(dá)。但一些限制因素，比如基因序列結(jié)構(gòu)，mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄的效率，肽或蛋白質(zhì)折疊方式，密碼子偏愛性等都可能導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)失敗［18］。推測可能原因之一為GLP-1多拷貝數(shù)目超過一定閾值，隨著GLP拷貝數(shù)的上升，新轉(zhuǎn)錄的mRNA的長度變長，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜化，從而破壞了mRNA原有的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致蛋白無法表達(dá)或表達(dá)受到抑制。另一種可能是GLP-1多拷貝數(shù)目大于等于12后盡管少量蛋白被表達(dá)，但是多拷貝蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，被多個(gè)蛋白降解酶識(shí)別導(dǎo)致蛋白瞬時(shí)降解，檢測時(shí)出現(xiàn)目的條帶丟失現(xiàn)象。

聚丙烯酰胺電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌BL21培養(yǎng)液、細(xì)胞周質(zhì)和不溶沉淀物中都含有目的蛋白。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)合成后，那些定位于細(xì)胞周質(zhì)區(qū)或外膜區(qū)的蛋白可以通過信號(hào)肽被轉(zhuǎn)運(yùn)到各自目的地。裂解液得到的目的蛋白一種可溶，另一種不可溶。可溶性的蛋白天然構(gòu)象不會(huì)被破壞，而不可溶性的蛋白由于構(gòu)象改變離心會(huì)形成沉淀，形成包涵體（0.5～1 μm）［16］。包涵體只有在變性劑存在的條件下（如尿素、SDS）才會(huì)溶解，并且回收困難，回收效率也不高。為了避免形成包涵體，目的蛋白通常被設(shè)計(jì)表達(dá)為分泌蛋白和可溶性蛋白。在異源表達(dá)蛋白分泌過程中，目的蛋白會(huì)分泌到細(xì)胞周質(zhì)區(qū)域，在那里很容易形成二硫鍵，或者分泌到容易被分離和純化的培養(yǎng)基中［17］。本實(shí)驗(yàn)中GLP-1多拷貝蛋白集中在細(xì)胞周質(zhì)區(qū)，可溶于水，說明其自然構(gòu)象未改變。另外，沉淀中也檢測到少量目的蛋白包涵體，推測形成這些包涵體的原因是IPTG誘導(dǎo)時(shí)GLP-1多拷貝蛋白表達(dá)效率過高造成部分目的蛋白未能及時(shí)正確折疊，從而使蛋白構(gòu)象發(fā)生改變導(dǎo)致蛋白發(fā)生沉降形成包涵體。

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（2015-02-01收稿）

Optimization for the expression of multi-copy peptides GLP-1 in vitro

LIN Song-feng1，3，ZHANG Rui1，WANG Dan-dan2，GUO Gang1
（1.Institute of Endocrinology，Metabolic Diseases Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Xie He Stem Cell Gene Engineering Company，Tianjin 300384，China；3.Ever Union Biotechnology Company Limited，Tianjin 301925，China）

Objective：To investigate the relationship between production and copy number coding sequence of the glucagon-like peptide -1（GLP-1）.Methods:Firstly，four repeated sequences for multi-copy GLP-1 peptides were linked as a motif and inserted into the vector pET-22b（+）.The completed plasmid including different numbers of GLP-1 copy was subsequently transformed into E.coli BL21 cells，which can be induced to express the interesting peptides by the reagent IPTG（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）.The expression of multi-copy GLP-1 was employed to optimize the fermentation.The conditions such as temperature and inducing time for highest protein yield were analyzed.Finally，the effects of different GLP-1 motif were confirmed to improve the production.Results:Multi-copy GLP-1 was expressed and secreted by E.coli in different conditions，the result demonstrated that a climax yield for protein was obtained at 26℃and 8 hours.Moreover，the production was negatively correlated with copy number of GLP-1.With the multi-copy，the production of peptides marked a significant decline.Conclusion:The final optimized condition to express multi-copy GLP-1 peptides is E.coli BL21 containing 4 copy motif vector cultured at 26℃with inducing time of 8 hours.

optimization；GLP-1；expression

Q7

A

1006-8147（2015）05-0388-05

林松峰（1983-），男，技術(shù)員，碩士在讀，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；通信作者：郭剛，E-mail：guogangtj@126.com。