血紅素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用

陳曉鵬，胡永成，方成，張麗娟，張榮信，黃文敬

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市天津醫院骨與軟組織腫瘤科，天津 300211）

血紅素氧化酶1在ADSCs增殖、凋亡和成骨分化的作用

陳曉鵬1，胡永成2，方成1，張麗娟1，張榮信1，黃文敬1

（1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津市天津醫院骨與軟組織腫瘤科，天津 300211）

目的：探討應用慢病毒介導血紅素氧化酶1（HO-1）基因轉染誘導脂肪來源基質干細胞（ADSCs）后對細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響。方法：取健康10周齡SD大鼠雙側腹股溝脂肪，分離、培養ADSCs，觀察第3代細胞形態并進行成骨和成脂分化研究，流式分析細胞表面標記物，確立分離細胞為ADSCs。利用基因重組技術構建HO-1基因重組慢病毒載體，并以Polybrene（8 μg/mL）介導慢病毒轉染ADSCs，倒置顯微鏡下觀察轉染細胞熒光表達優化轉染復數，Western blot檢測HO-1蛋白表達。設HO-1轉染組（A組）、空載體轉染組（B組）和未轉染組（C組）；MTT，流式分析和茜素紅鈣結節染色分別檢測各組增殖、凋亡和成骨分化情況。結果：分離獲得的ADSCs具有多向分化潛能：CD29（+）、CD44（+）、CD90（+）、CD31（-）、CD45（-）；經菌液PCR和Western blot鑒定HO-1基因重組慢病毒載體構建成功，與B、C組相比，A組具有較高的細胞活性（P＜0.05），無血清培養基中較低的凋亡率（P＜0.05），并增加細胞鈣化基質形成的量（P＜0.05）。結論：成功構建HO-1基因重組慢病毒表達載體并轉染大鼠ADSCs，HO-1基因轉染入ADSCs后表達HO-1蛋白成功，HO-1轉染后可以發揮對ADSCs促增殖、抗凋亡和促成骨分化的作用。

脂肪基質干細胞；血紅素氧化酶1；慢病毒載體；成骨分化

骨組織工程為骨缺損修復提供了一種有效的方法，其中脂肪基質干細胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）因取材方便、易獲得，具有多種定向分化潛能的特點成為骨組織工程良好的種子細胞［1］。近年來國內外學者對ADSCs成骨分化及其促進骨缺損修復等功能進行了大量研究。但單純的ADSCs植入體內后細胞大量凋亡，且ADSCs較骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）有脂肪分化的潛能［2］。血紅素氧化酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是血紅素代謝的限速酶，因其可以通過一種或幾種代謝產物發揮抗凋亡、抗炎等作用而受到重視［3］。將HO-1基因修飾ADSCs有望克服以上不足，更好地發揮血管新生和成骨分化的促進作用。因此，我們構建了攜帶HO-1基因的慢病毒，將其感染ADSCs，長期傳代，獲得持續穩定表達，并對其生物學特性進行觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器10周齡清潔雄性SD大鼠8只，體質量200～300 g，購自中國人民解放軍軍事科學研究院。

FBS（HyClone公司，美國）；L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；雙抗（青霉素-鏈霉素，GIBCO公司，美國）；聚凝胺（polybrene），I型膠原酶，抗壞血酸，地塞米松，β-甘油磷酸鈉，甲基黃嘌呤（IBMX），吲哚美辛（Sigma公司，美國）；磷酸鹽緩沖液（PBS），茜素紅（生工，中國）。慢病毒載體pZsGGFP、包裝質粒packA、packB、packC，293T細胞由天津醫科大學免疫炎癥實驗室張榮信教授惠贈；質粒pUC57-HO-1由金唯智（蘇州，中國）合成，Plasmid抽提試劑盒（Qiagen公司，德國），大鼠HO-1抗體（Santa Cruz生物公司，美國），CD29-PE，CD31-APC，CD44-PE，CD45-FITC，CD90-FITC（BD eBioscience，美國）。Plus-20離心超濾裝置（Millipore公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Accuri C6流式細胞儀（BD，加拿大）。

1.2 大鼠ADSCs分離、培養及鑒定

1.2.1 大鼠ADSCs分離、培養無菌條件下取脂肪組織置入無菌離心管中，PBS沖洗3遍，剔除血管、筋膜組織后剪碎，0.1％Ⅰ型膠原酶37℃震蕩消化1 h，等體積DMEM/體積分數10％的FBS中和，采用密度梯度離心法分離培養大鼠ADSCs，1 000 r/min，離心5 min，0.22 μm篩網過濾，1 000 r/min，離心5 min，棄上清，DMEM培養基重懸細胞，將細胞接種于培養瓶中，用DMEM培養基含10％的FBS和1％雙抗培養。48 h后換液，除去未貼壁的細胞。細胞生長至80％～90％融合狀態時，0.05％胰蛋白酶-0.02％ EDTA消化傳代。取生長狀態良好的第3～5代細胞用于后續實驗。

1.2.2 大鼠ADSCs鑒定倒置顯微鏡下觀察ADSCs形態及其生長變化；在成骨（DMEM，5％FBS，1％雙抗，0.1 μmol/L地塞米松+50 μmol/L抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉）和成脂（DMEM，5％ FBS，1％雙抗，10 mg/L胰島素+1 μmol/L地塞米松、100 μmol/L吲哚美辛、500 μmol/L的甲基黃嘌呤）培養基上誘導21 d培養ADSCs，每3 d換液，觀察其多分化潛能；流式細胞儀分析ADSCs表面CD29、 CD44、CD90、CD31、CD45分子的表達。

1.3 HO-1慢病毒表達載體構建及HO-1慢病毒獲取

1.3.1 PCR法獲得HO-1基因片段從Genebank中提取大鼠HO-1基因（NM_012580）編碼區序列，根據慢病毒表達載體pZsG酶切位點要求，由金維智公司將HO-1基因合成在質粒pUC57-HO-1中。將pUC57-HO-1和pZsG分別進行NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶以膠回收試劑盒回收。

1.3.2 HO-1基因片段與慢病毒載體pZsG重組

切膠回收產物定向連接經大腸桿菌轉化，對長出的克隆進行PCR鑒定，共挑選5個克隆。引物序列：上游引物5′-ATGGAGCGCCCACAGCTCG-3′，下游引物5′-ACTGCCACGGTCGCCAACAG-3′，其中PCR鑒定為陽性的克隆，證明HO-1已經定向連入pZsG，命名為pZsG-HO-1。

1.3.3 慢病毒載體大量抽提按照Plasmid抽提試劑盒操作手冊步驟分別抽提慢病毒載體質粒：pZsG-GFP、pZsG-HO-1、packA、packB和packC。保證所提質粒DNA的吸光度（A260/A200）值為1.8～2.0，-20℃保存。

1.3.4 慢病毒包裝取生長狀態良好的293T細胞，包裝前按細胞密度1×105/mL接種于含完全培養基的10 cm培養皿中，待細胞融合率約70％時，開始包裝。包裝前1 h更換無血清培養基，將上述表達質粒與包裝質粒按1∶3∶1∶1的質量比混合，再添加3倍體積的PEI，混勻后37℃孵育20 min，分別加入滿足包裝要求的293T細胞中。48 h和72 h后收集病毒上清，-80℃保存備用。

1.4 HO-1重組慢病毒載體轉染ADSCs取第3代大鼠ADSCs，待細胞生長達70％～80％融合后棄上清，加入10 mL的慢病毒液和8 μg/mL的聚凝胺（polybrene），置于37℃、5％CO2及飽和濕度孵育箱中孵育，6 h后全量換液，更換完全培養基，轉染24、48、72 h后根據空載體表達綠色熒光的特點，采用倒置熒光顯微鏡觀察不同感染復數（multiplicity of infection，MOI）10、15、20、30、50、100下慢病毒的感染效率，選擇熒光表達效率最高、細胞生長狀態最佳的MOI值作為最佳MOI值進行后續實驗。Western blot驗證HO-1重組慢病毒載體轉染ADSCs后表達情況。

1.5 觀測指標

1.5.1 MTT法檢測轉染后ADSCs生長情況根據處理方法不同分為3組：A組（HO-1基因重組慢病毒載體轉染ADSCs）、B組（pZsG-GFP慢病毒載體轉染ADSCs）、C組（未轉染ADSCs），每組設3個復孔。取生長狀態良好不同組的第3代ADSCs，經消化離心重懸細胞后計數，按細胞密度1×103個/孔接種于96孔板中，于37℃、5％CO2及飽和濕度孵育箱中培養，隔天換液1次。分別于轉染后1、2、3、4、5、6、7 d進行MTT檢測，在酶聯免疫儀上490 nm下測定吸光度值（OD）。

隨著我國生活水平和醫療水平的提高，老年人的平均壽命不斷延長，相對的老年人的可勞動年齡也不斷延長。老年人豐富的勞動經驗和較于年輕人更敬業的勞動精神是其具有的最核心的競爭力。創造有利于老年人力資源開發的政策環境，充分開發老年人力資源，大力開展老年教育，不斷更新老年人的知識，鼓勵活到老學到老，使老年人適應新科技的不斷創新，從而為其創造參與社會勞動的有利條件。并且在老齡人工作經驗和技能指導優勢的工作領域上，適當延長老齡人的退休年齡增加勞動力的供給，充分發揮利用老年勞動力資源，彌補我國勞動力數量的減少所帶來的劣勢。

1.5.2 流式細胞儀分析HO-1高表達對ADSCs抗凋亡的影響實驗分組同1.5.1。按細胞密度1×105個/孔接種于6孔板中，當細胞貼壁后更換無血清培養基，培養3 d后收集各組細胞。根據凋亡試劑盒（三箭，天津）要求進行染色，C6流式分析儀分析各組細胞凋亡情況。

1.5.3 轉染后ADSCs成骨分化觀察實驗分組同1.5.1。茜素紅染色：將3組細胞按細胞密度5×104個/孔接種于6孔板中，成骨培養基中培養3周后，PBS沖洗3次，每次5 min，無水甲醇固定10 min后，雙蒸水沖洗3次，每次5 min，加入pH 7.4的1％茜素紅染液，于37℃恒溫箱中孵育40 min，雙蒸水沖洗3次，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節形成情況。

2 結果

2.1 大鼠ADSCs形態學觀察及鑒定原代細胞培養48 h后，倒置顯微鏡下可見細胞呈長梭形貼壁生長；成骨誘導3周后茜素紅染色可見多數細胞胞質中有紅色顆粒或大片紅色沉淀。成脂誘導3周后油紅O染色可見細胞內有紅色脂滴。流式細胞儀檢測示細胞表面標志物CD29（＋）、CD44（＋）、CD90（＋）、CD31（－）、CD45（－）（圖1）。

2.2 含HO-1的慢病毒表達載體構建HO-1基因片段經限制性內切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切后可獲得長度為869 bp的片段產物（圖2A）。隨機挑選5個單克隆菌落行PCR鑒定，其中2、3、4為陽性，片段大小約為900 bp（圖2B）。與Genbank中的參考序列一致，提示成功構建HO-1基因慢病毒載體。

圖1 ADSCs形態學、多向分化潛能及表面標記物鑒定Fig 1 Identification of ADSCs from morphology，multi-differentiation and surface marker

圖2 慢病毒表達載體pZsG-HO-1的構建Fig2 Construction of lentiviral pZsG-HO-1 plasmid

2.3 重組慢病毒的感染效率及目的基因的表達

慢病毒感染ADSCs 96 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光，結果顯示：當MOI值為10、15時可見不足50％熒光表達；當MOI值為20時，可見大部分（90％）ADSCs表達綠色熒光。當MOI值為30時并不能有效增加熒光表達，且隨著MOI值的增加，細胞生長狀態較差，出現漂浮細胞，提示對大鼠ADSCs而言，MOI為20時為慢病毒的最佳感染復數，慢病毒感染ADSCs細胞達到90％以上的感染效率，符合基因治療對載體的要求（圖3）。Western blot結果表明，實驗組HO-1蛋白水平顯著高于空載體組（P＜0.05），差異有統計學意義（圖4）。

圖3 不同梯度慢病毒MOI轉染ADSCs后熒光表達Fig 3The fluorescence of ADSCs transfected with the gradient MOI of lentivirus

圖4 Western blot檢測慢病毒介導HO-1轉染ADSCsFig 4HO-1 expression in ADSCs mediated by lentivirus and evidenced by Western blot

2.4 MTT法檢測轉染后ADSCs活性MTT法顯示：轉染后2 d開始，A組細胞生長良好，OD值比較有統計學意義（P＜0.05）；而空載體組和未轉染組細胞生長無明顯變化，OD比較差異無統計學意義。隨著培養時間延長，各組細胞生長呈上升趨勢，其中A 組OD值顯著優于B組，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。

2.5 流式細胞技術分析轉染后ADSCs凋亡流式細胞儀檢測結果（表1）表明，A組細胞凋亡率較B組和C組明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而B組與C組之間比較差異無統計學意義，表明HO-1重組基因高表達可以降低ADSCs在無血清條件下的凋亡率，對細胞發揮保護效應。

圖5 MTT檢測不同轉染組ADSCs的細胞活性Fig 5ADSCs viability of ADSCs in different transfection groups measured by MTT

表1 不同轉染組在無血清培養基下的凋亡率（％）Tab 1 The apoptosis rate of ADSCs in different groups in the medium without serum（％）

2.6 茜素紅鈣基質染色轉染后3周，A組可見較多細胞出現大量片狀融合褐色礦化結節（圖6）；Image J軟件分析顯示，A組礦化結節形成區域較B組和C組明顯增多，差別有統計學意義（P＜0.05）；而B組及C組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 茜素紅染色分析不同轉染組鈣基質形成情況Fig 6Calcium deposition of different groups stained by alizarin red

3 討論

ADSCs具有多向分化潛能，為組織工程骨構建增加了細胞成分，是目前骨組織工程的研究熱點，本研究中成功分離提取了ADSCs［1］。骨缺損局部微環境常面臨低氧、氧化應激的損傷，不利于細胞存活，使得植入體內的細胞早期凋亡率增加，1～2周內細胞在支架上逐漸消失，4周后全部消失［4］。ADSCs聯合支架植入體內達不到骨修復的效果［5］。同時植入體內的種子細胞缺乏有效的刺激使其達到骨修復的目的。近年來，在心血管領域廣泛應用的HO-1通過代謝血紅素產生CO、膽綠素、二價鐵離子，可以發揮抗炎、抗凋亡等細胞保護作用，將其引入骨組織工程可能利于骨修復［6］。

與蛋白為基礎的治療相比，攜帶基因成本低、效率高，1996年第一次嘗試基因治療應用于骨組織工程以來，基因治療在骨組織工程中得到了廣泛地研究［7］。為了更好地將目的基因與靶細胞整合，達到基因治療的目的，基因載體的選擇尤為關鍵。慢病毒載體能夠攜帶目的基因與靶細胞基因組整合，使得目的基因能夠長期穩定表達，且具有不易誘導宿主免疫反應等優點［8］。更重要的是，慢病毒載體可轉染分裂細胞及非分裂細胞，攜帶基因片段容量較大［9］。因此，我們研究中選擇慢病毒表達載體作為目的基因的攜帶工具。

本實驗將通過NotⅠ和BamHⅠ酶切獲得的大鼠HO-1基因片段與經相同酶切的慢病毒表達載體pZsG連接后轉化入E.coli DH5α感受態細胞，并通過酶切電泳分析儀和設計特異性引物進行菌液PCR對重組DNA進行鑒定，結果與GenBank中序列大體一致，初步驗證構建的重組質粒目的基因片段為大鼠HO-1基因。此外，Western blot證明HO-1基因已經成功轉染ADSCs并出現蛋白水平表達，表明慢病毒介導HO-1成功導入ADSCs中，建立HO-1/ADSCs模型。

骨生成過程涉及細胞增殖、細胞趨化、基質合成和成骨分化［10］。細胞活性是細胞發揮功能的關鍵，該實驗證實轉染HO-1基因后可維持較高的細胞活性，與HO-1在內皮細胞發揮的作用一致［3］，而血管平滑肌細胞中高水平的HO-1可以抑制細胞增殖［11］，HO-1這種細胞選擇性更有利于血管新生，但其作用機制仍不清楚，需要進一步研究。另外，HO-1在內皮細胞中還具有抗凋亡的特性，將其作為生長因子引入骨組織工程的種子細胞可能更有利。在四肢骨缺損常面臨缺血微環境，造成植入體內的ADSCs處于營養物質不足、低氧等應激狀態［12］，該實驗通過體外采用無血清條件來模擬體內環境，證實HO-1轉染組具有相對較低的細胞凋亡率，與之前很多關于保護心肌免受缺血再灌注損傷的研究一致［13］。良好的細胞活性和無血清狀態下的抗凋亡效應，二者相輔相成共同保證參與骨生成的細胞數量。同時，該研究中還證實轉染HO-1組可以促進礦化基質的合成，提示HO-1具有直接的促成骨效應［3，14］。有趣的是，Zwerina等［15］研究發現HO-1可以調節破骨細胞生成和骨吸收，提示HO-1也可以參與骨重建過程，可能在骨修復的不同階段發揮不同的效應。

綜上，HO-1在ADSCs可以發揮促增殖、抗凋亡的特性，同時，在適當的誘導環境下可以促進成骨分化，慢病毒介導HO-1轉染ADSCs有望作為種子細胞應用于骨組織工程。

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（2015-03-03收稿）

Effect of proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation of ADSCs transduced with heme oxygenase-1

CHEN Xiao-peng1，HU Yong-cheng2，FANG Cheng1，ZHANG Li-juan1，ZHANG Rong-xin1，HUANG Wen-jing1
（1.Graduate School，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Department of Bone and Soft Tissue Tumors，Tianjin Hospital，Tianjin 300211，China）

Objective：To investigate the proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation effect of heme oxygenase-1（HO-1）overexpression mediated by lentivirus on adipose-derived stromal cells（ADSCs）.Methods:Fat tissue was harvested from inguinal area of 10-week-old SD rats，after which ADSCs were isolated and cultured.The morphology of third passages were observed，the multidifferentiation effect and surface markers were investigated to identify ADSCs.The lentivirus vector containing HO-1 gene was constructed through genetic recombination.ADSCs were transfected by lenvirus with polybrene（8 μg/mL）.The multiplicity of infection was optimized and HO-1 expression in ADSCs was tested by Western blot.Cells were divided into three groups:ADSCs transfected with Lenti-HO-1 （group A），ADSCs transfected with empty vector（group B）and ADSCs（C group）.The proliferation，apoptosis and osteogenic differentiation effect were investigated by MTT assay，flow cytometry and alizarin red staining.Results：ADSCs had a multi-differentiation character，CD29（+），CD44（+），CD90（+），CD31（-），CD45（-）.The lentivirus containing HO-1 was constructed successfully evidenced by bacteria PCR and Western blot.Compared with group B and C，cells of group A had a better viability（P＜0.05），exhibited anti-apoptotic effect（P＜0.05）and more osteogenic differentiation（P＜0.05）.Conclusion:The lenvirus vector containing HO-1 gene is successfully constructed，and HO-1 could express in ADSCs transfected with Lenti-HO-1.HO-1 expression could enhance pro-viability and anti-apoptotic effect，and it could stimulate osteogenic differentiation of ADSCs.

adipose-derived stromal cells；heme oxygenase-1；lentivirus；osteogenic differentiation

Q81

A

1006-8147（2015）05-0379-06

天津市自然科學基金資助項目（12JCYBJC16400），天津市衛生局科技基金資助項目（2011KY24）

陳曉鵬（1987-），男，碩士在讀，研究方向：骨損傷修復；通信作者：胡永成，E-mail:yongcheng.hu@yahoo.com。