體外構建合成成纖維細胞生長因子-1 mRNA及其表達的初步研究

吳志敏，李光明，白潔，王金鑫，賈欣雨，杜曉玲，朱澤

（天津醫科大學病原生物學教研室，天津 300070）

體外構建合成成纖維細胞生長因子-1 mRNA及其表達的初步研究

吳志敏，李光明，白潔，王金鑫，賈欣雨，杜曉玲，朱澤

（天津醫科大學病原生物學教研室，天津 300070）

目的：參照mRNA穩定性理論，設計并體外轉錄合成具有一定穩定性的FGF1 mRNA，對其表達進行初步驗證。方法：在pT7TS載體上加poly A、βglobin 3′、5′UTR，增加GC含量優化設計FGF1序列，并結合mRNA二級結構分析其穩定性，目的序列瓊脂糖凝膠電泳及測序驗證后，體外轉錄合成FGF1 mRNA，待濃度及片段大小驗證后，行動物實驗，通過ELISA法檢測FGF1 mRNA表達。結果：二級結構分析顯示，優化后FGF1序列穩定性更高；雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示pT7TS-FGF1重組載體構建成功，測序驗證正確；聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示合成mRNA大小正確。ELISA檢測顯示，實驗組（92.48 pg/mL）小鼠血清中FGF1蛋白含量較對照組（13.59 pg/mL和15.54 pg/mL）明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；對照組間FGF1蛋白含量接近，二者無統計學差別（P＞0.05）。結論：成功構建并體外轉錄合成穩定的FGF1 mRNA，mRNA與魚精蛋白結合后回輸小鼠在體內成功表達。

體外轉錄；mRNA穩定性；成纖維細胞生長因子-1；體內表達

成纖維細胞生長因子-1（fibroblast growth factor-1，FGF1）是一種細胞因子，具有促有絲分裂作用［1］，研究發現其有潛在的調節營養平衡作用［2］。2014年，美國科學家通過動物實驗證實［3］，糖尿病小鼠單次注射FGF1蛋白，可持續2 d以上將血糖水平恢復至正常范圍。與普通胰島素增敏藥相比，FGF1蛋白不會引起小鼠體質量增加、心臟和肝臟危險性問題等副作用。但FGF1克隆蛋白是由擬核細菌表達的異源性蛋白，免疫原性和安全性問題限制了其廣泛應用。而近來發展的mRNA體外合成技術，能夠很好地解決這一問題。2012年Petsch等［4］體外轉錄合成穩定性mRNA的抗流感疫苗，并在小鼠體內成功表達出蛋白即抗體，抵抗流感病毒的感染。本研究通過優化設計并體外轉錄合成穩定的FGF1 mRNA，與魚精蛋白結合成體外穩定結構，小鼠皮下注射，觀察其在小鼠體內的表達蛋白，為體外合成mRNA技術構建的細胞因子預防和治療疾病，進一步為FGF1細胞因子治療糖尿病奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，聚丙烯酰胺凝膠RNA回收試劑盒（Poly-Gel RNA Extraction Kit）購自Omega公司，體外轉錄試劑盒（mMESSAGE mMACHINE Kit）購自Ambion公司，Taq DNA聚合酶、限制性內切酶SpeⅠ、SalⅠ和EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、RNA marker購自大連寶生物工程有限公司。Trans2K Plus II DNA Marker、DH5α感受態、PCR混合試劑購于北京全式金生物技術有限公司，引物合成及測序于蘇州金唯智生物科技有限公司。魚精蛋白購自Sigma公司，人酸性成纖維細胞生長因子（FGF1）ELISA試劑盒為美國Rapidbio產品。

1.1.2 儀器設備渦旋振蕩器（Vortex－genie2）、高速冷凍離心機（Eppendorf 5415R centrifuge）、Nanodrop （ND－1000型）、PCR儀（Eppendorf 22331 Hamburg）、Real－time PCR儀（BIO－RAD iQ5）、電泳儀（北京六一儀器廠DYY－7C型）、凝膠成像系統（BIO－RAD ChemiDocTMXRS）、超低溫冰箱（海爾DW－86L388）、電子天平（Sartorius CPA64）。

1.2 質粒和動物pT7TS購自Addgene官網，雄性ICR小鼠（18～20 g）30只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 pT7TS載體優化pT7TS送金唯智公司測序確定。載體T7啟動子之后，設計加入序列，分別為globin 5′UTR、酶切位點、globin 3′UTR、poly A結構A60。由蘇州金唯智公司合成并測序驗證。

1.3.2 FGF1序列合成及目的載體構建FGF1目的序列參照GeneBank NM_001257210.1，結合軟件二級結構預測，在不改變編碼氨基酸的情況下進行種屬偏好密碼子優化，調整GC含量并做分析。選擇其中GC含量高且穩定性及結構合理的序列，經序列堿基分析后兩端分別設計酶切位點為SpeⅠ和SalⅠ，由蘇州金唯智公司合成。前期優化的質粒pT7TS和目的序列FGF1在37℃水浴條件下同時進行SpeⅠ和SalⅠ雙酶切2 h，1％瓊脂糖凝膠電泳72 V 25 min后用DNA回收試劑盒回收，使用T4 DNA連接酶將目的片段與載體片段于PCR儀中16℃連接過夜。

1.3.3 克隆菌的轉化及鑒定連接產物轉化于大腸桿菌DH5α感受態細胞中，接種于氨芐抗性的LB平板上，37℃培養箱中過夜。16～18 h內從LB平板上挑選多個單克隆菌，依次接種于5 mL LB液體培養基（氨芐抗性）的試管中，放置于搖床，37℃，200 r/min搖菌1 h。后每管取1 μL菌液行菌落PCR，引物為Forward：GGCAGATCTGTCGACCTCGAGACTAGTATGGCTGAAGGGGAAATCACCACC，Reverse：AACCAGATCCTAGTCAGTCGATATCTTAATCAGAAGAGACTGG CAGGGGG。條件：95℃3 min；95℃30 s，50℃1 min，68℃1 min，35 REP；68℃4 min；HOLD 4℃。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產物，篩選陽性單克隆菌繼續培養16～20 h，按說明書抽提質粒。提取的質粒以SpeⅠ和SalⅠ雙酶切（37℃水浴，4 h），瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定陽性的重組質粒用Nanodrop測定濃度，并送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，與理論序列比對。

1.3.4 FGF1 mRNA體外合成在無菌無RNA酶條件下，按照mMESSAGE mMACHINE體外轉錄操作步驟，將鑒定陽性的重組質粒用EcoRⅠ單酶切線性化（37℃、2 h），加入EDTA醋酸銨混合液和無水乙醇停止反應，-20℃放置15 min。微型離心機以最大轉數（13.2×1 000 r/min）離心15 min，去上清，槍頭小心地移去殘余液體。按照重組質粒濃度計算，用無酶水重懸線性質粒濃度為0.5～1 μg/μL。室溫下將轉錄反應組分混合，1 μL線性質粒于20 μL體系，37℃2 h。加入TURBO DNase 1 μL反應37℃15 min，降解模板DNA。后加入50 μL LiCl溶液沉淀RNA，充分混勻，-20℃冷卻≥30 min，以最大轉速（13.2×1 000 r/min）4℃15 min離心。小心吸除上清，用1 mL70％乙醇沖洗1次，再次以同樣條件離心。小心吸除70％乙醇，無RNA酶水溶解后測定RNA濃度，-70℃保存。過程中所有溶液均為試劑盒自帶或用無RNA酶水配制。

1.3.5 體外合成mRNA的鑒定獲得mRNA通過聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證后，使用聚丙烯酰胺凝膠RNA回收試劑盒進一步純化回收，獲得更純的FGF1 mRNA，并由Nanodrop測定濃度。后續實驗用到的mRNA均由前面方法重復操作獲得。

1.3.6 mRNA-魚精蛋白復合物獲得按照參考文獻［5］的方法，換算mRNA濃度后，在無菌無RNA酶室溫條件下，將0.5 μg魚精蛋白：1 μg mRNA（1∶2）于100 μL的緩沖液（150 mmol/L NaCl，10 mmol/L Hepes，pH7.4）中混合孵育，搖勻5 min。不加mRNA的魚精蛋白按同樣步驟進行，用于下一步注射小鼠時的對照。所有用到的溶液均由無RNA酶水配制，操作迅速，搖勻后立即置于冰上。

1.3.7 FGF1 mRNA-魚精蛋白在小鼠體內的表達

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為3組，每組10只，分別為1組：生理鹽水對照組（0.1 mL/10 g）；2組：空白魚精蛋白對照組（0.1 mL/10 g）；3組：FGF1 mRNA-魚精蛋白組（0.1 mL/10 g）。每天定時注射1次，連續注射3 d，第4天通過尾靜脈取血。用干凈的1.5 mL離心管收集血液，室溫放置2 h使血清析出，4℃3 000 r/min離心10 min，小心吸取上清。按照ELISA檢測試劑盒說明步驟操作：設置標準品孔、樣本孔和空白孔。標準品依次稀釋為：1 000、500、250、125、62.5、0 pg/mL。標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL；待測樣本孔加待測樣本10 μL和樣本稀釋液40 μL。隨后標準品孔和樣本孔加HRP標記的檢測抗體50 μL，封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5次。所有孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min，再加入終止液50 μL，15 min內酶標儀測定各孔450 nm處OD值。建立標準曲線，計算各孔FGF1蛋白含量。

2 結果

2.1 優化后載體pT7TS序列根據mRNA穩定性理論及參考文獻（討論部分），優化設計后由公司合成并測序驗證，得到了目的pT7TS序列，如圖1。得到的質粒由T7作為啟動子，能夠在序列末端單酶切線性化，滿足后續的實驗要求。

圖1 優化pT7TS結構圖Fig 1The optimized structure of pT7TS

2.2 FGF1序列的設計在保證編碼氨基酸不變的前提下，進行種屬密碼子偏好優化，并適當調整增加目的序列中GC含量，由公司結合二級結構預測軟件進行分析。如圖2，序列A為優化之后，GC含量為58.97％，序列B為原始野生型序列，GC含量為51.50％。分析二級結構后初步認為，序列A的折疊和環相對較少，會比較穩定一些。

2.3 pT7TS-FGF1重組載體構建合成FGF1與優化pT7TS連接，經氨芐青霉素選擇和菌落PCR鑒定陽性的菌液所提重組載體，經SpeⅠ和SalⅠ雙酶切驗證，如圖3。10個單克隆菌液PCR，其中有8個得到的主條帶均在500 bp附近，與FGF1 PCR條帶大小相符。選取其中1個擴增抽提得到的重組質粒，未酶切的顯示有4條條帶，符合質粒電泳結果，其中較大的1條在3 000～4 000 bp之間。雙酶切后得到的2條條帶分別約3 000 bp和500 bp，與優化pT7TS和FGF1的大小一致，初步說明重組載體構建成功。送公司測序，結果正確。

圖2 調整堿基后編碼FGF1蛋白的mRNA結構Fig 2 The secondary structure of optimized mRNA coding FGF1

圖3 pT7TS-FGF1瓊脂糖凝膠電泳Fig 3Agarose gel electrophoresis of pT7TS-FGF1

2.4 體外合成mRNA的檢測圖4結果顯示，轉錄產物條帶大小在700 nt附近，且條帶單一。真核mRNA的結構中包括5′cap、5′UTR、編碼區、3′UTR 和poly A尾（圖5），合成產物的條帶位置符合理論合成FGF1 mRNA的大小。Narnodrop測得20 μL轉錄體系中，得到mRNA的量約為15 μg，OD260/280約1.9～2.0。每次體外轉錄合成產物略有差別。

圖4 mRNA聚丙烯凝膠電泳檢測結果Fig 4PAGE result of synthetic mRNA

圖5 真核mRNA結構Fig 5The structure of eukaryotic mRNA

2.5 ELISA檢測mRNA在小鼠體內的表達ELISA法檢測3組小鼠血清中的FGF1含量，結果如圖6。實驗組（92.48 pg/mL）血清中FGF1的含量顯著高于空白對照組（13.59 pg/mL）和魚精蛋白對照組（15.54 pg/mL），說明mRNA進入體內并成功表達出FGF1蛋白，空白與魚精蛋白對照組FGF1蛋白含量的差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖6 ELISA檢測血清中重組人FGF1蛋白的含量Fig 6Human FGF1 content was identified by ELISA

3 討論

基因治療作為一種新的治療手段受到廣泛認可，mRNA因其自身優勢而逐漸受到重視。體外轉錄mRNA后導入體內表達，可翻譯成具有功能的蛋白質［6］，得到的蛋白是真核表達的，且具有自體同源性［7］，與體外表達得到的蛋白相比，減少了MHC限制等排斥反應及其他潛在的不安全因素。同時mRNA穩定性的問題也隨著研究的逐步深入而破解，Petsch等［4］體外合成特異性mRNA并開發出新型抗流感疫苗，實現了設計并體外轉錄mRNA在體內表達的成功應用。

真核mRNA結構包括5′cap、5′UTR、開放閱讀框、3′UTR和polyA尾等部分，各部分均與穩定性密切相關。研究顯示，使用帽子類似物ARCA或者牛痘病毒加帽系統代替常規的帽子結構，可顯著提高mRNA的翻譯率，而翻譯常常被作為穩定性的一個標準。常規帽子類似物添加方向具有不確定性，反向添加的帽子結構其甲基化會受到影響，故而翻譯效率大大下降［8］；而且ARCA本身在細胞中就具有較長的半衰期［9］。PolyA中堿基數對mRNA穩定性也起到重要作用，該結構能夠增加mRNA的穩定性和蛋白的表達［10］，polyA的減少意味著mRNA的衰退。當腺苷酸殘基A少于約20 nt時，mRNA便不能結合多聚A結合蛋白（PABP）進行翻譯，mRNA就會進入降解程序［11］。mRNA的降解與UTR，尤其是3′UTR的末端有密切關系，對UTR的優化常通過使用globin的UTR。非洲爪蟾蜍β globin的5′和3′UTR對體外轉錄的穩定性有重要的意義［12］，已有研究表明，globin 5′UTR提高了翻譯效率而3′UTR增加了mRNA的穩定性［13］。另有研究發現，編碼globin、膠原蛋白及免疫球蛋白等常見蛋白的mRNA相對來說會更穩定［14］。本研究序列設計中也引入globin UTR來穩定體外轉錄合成的mRNA。開放閱讀區GC含量高的mRNA會更加穩定，CUREVAC GMBH［15］通過在原野生型基礎上增加GC含量，構建GC穩定型序列。不同種屬密碼子具有選擇偏好，個體內同一種氨基酸的不同tRNA可能有差別，當相應tRNA較少時，可能會大大減緩翻譯的進行［16］。魚精蛋白結合mRNA后能夠抵抗血清對mRNA的降解而起到穩定作用［5］。一些研究發現，魚精蛋白與mRNA結合的復合體通過TLRs受體作用，對人和小鼠的免疫細胞有很強的活化作用［17］。

本研究參照RNA穩定性理論及前期研究基礎，通過對載體pT7TS進行加5′UTR、3′UTR、polyA等結構優化，以及適當調整酶切位點，獲得了優化的體外轉錄載體。選用pT7TS是由于該質粒含有能被噬菌體RNA聚合酶特異性識別的T7啟動子，T7較其他如SP6啟動子等有更好的轉錄速率。pT7TS通過其酶切位點能夠保證3′、5′UTR、polyA序列的加入，也能確保后期單酶切使質粒線性化，滿足轉錄的要求。在此基礎上插入GC含量增加、密碼子優化并二級結構初步分析后的FGF1序列，聚合酶轉錄合成的同時加入了5′cap結構，在序列設計上保證了目的mRNA在細胞內外的相對穩定性，5′cap結構保證識別核糖體和啟動合成蛋白。純化后的mRNA與魚精蛋白結合后，抵抗RNA酶的消化［5］，進一步增加了mRNA體內穩定。通過電泳及ELISA結果看到，研究中成功合成了目的mRNA并在體內實現了表達。

在合成穩定mRNA自身安全性的基礎上，通過氯化鋰沉淀法可以去除寡核苷酸、無機鹽和大部分蛋白。而用HPLC方法［18］對產物進一步純化，可以適應更高純度mRNA使用的需求。

本研究成功完成了FGF1穩定性mRNA的體外合成并在體內表達出目的蛋白。獲得的FGF1蛋白是機體自身翻譯產物，與異體甚至原核表達的蛋白相比，避免了MHC限制等排斥反應以及其他不安全因素。盡管FGF1作用機制尚未完全明確，且本研究表達的FGF1蛋白是否具有功能尚待進一步深入論證，但該方法的表達成功以及mRNA自身所具有的特質，為FGF1治療糖尿病以及其他疾病的基因治療提供了一種新的途徑，為找到FGF1調節血糖作用的信號路徑和受體提供了一定的實驗基礎。

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（2015-03-17）

Preliminary study on the construction，the synthesis of FGF-1 mRNA in vitro and its expression in vivo

WU Zhi-min，LI Guang-ming，BAI Jie，WANG Jin-xin，JIA Xin-yu，DU Xiao-ling，ZHU Ze
（Department of Microbiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

Objective：To optimize and synthesize FGF-1 mRNA by in vitro transcription and investigate its stability and expression both in vitro and in vivo.Methods：Poly A and β globin 3′and 5′UTR on pT7TS were added.FGF1 sequence were optimized by increasing GC content and analyzing its stability with the secondary structure of mRNA.Constructed pT7TS-FGF1 then verified it correction by agarose gel electrophoresis（AGE）and sequencing.After the in vitro transcription FGF1 mRNA，its concentration was measured by Narnodrop and its size was analysed by polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）.The expression of mRNA in vivo was detected by ELISA in mice assay. Results：The optimized FGF1 was more stable after being predicted and analyzed by secondary structure.Double digestion verification of agarose gel electrophoresis and the sequencing showed that pT7TS-FGF1 had been constructed successfully.The band on PAGE verified that the mRNA size was correct.ELISA assay result showed the expression of the FGF1 protein in serum in the test group（92.48 pg/mL）was higher than that of the control group（13.59 pg/mL and 15.54 pg/mL）（P＜0.01）.No significant difference was found in the expression of the FGF1 protein in serum between the control groups（P＞0.05）.Conclusion：FGF1 mRNA can be successfully constructed and synthesized by in vitro transcription.mRNA bounding with protamine can be expressed in the injected mice.

in vitro transcription；mRNA stability；FGF1；in vivo expression

Q7

A

1006-8147（2015）05-0375-04

國家自然科學基金資助項目（81402215）；天津醫科大學基金資助項目（2013KYQ13）

吳志敏（1990-），男，碩士在讀，研究方向：轉錄機制及疾病的生物治療；通信作者：朱澤，E-mail:zhuze@tmu.edu.cn。