經(jīng)穿膜肽與PEG修飾的核糖體失活蛋白Gelonin抗腫瘤作用的研究

張婭潔，王慧媛，陳應(yīng)之，湯懿斯，3，楊志民，黃永焯

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；4.美國(guó)密西根大學(xué)藥學(xué)院，美國(guó)密西根州 48109）

論著

經(jīng)穿膜肽與PEG修飾的核糖體失活蛋白Gelonin抗腫瘤作用的研究

張婭潔1，2，王慧媛2，陳應(yīng)之2，湯懿斯2，3，楊志民1，4，黃永焯2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510405；4.美國(guó)密西根大學(xué)藥學(xué)院，美國(guó)密西根州 48109）

目的：通過(guò)對(duì)核糖體失活蛋白Gelonin進(jìn)行化學(xué)修飾，利用穿膜肽和聚乙二醇（PEG）偶聯(lián)來(lái)提高其到達(dá)腫瘤部位和進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的能力，使Gelonin更高效地發(fā)揮抑瘤作用。方法：利用FPLC Superdex75分子篩預(yù)裝柱純化系統(tǒng)對(duì)所修飾的Gelonin進(jìn)行純化后，在不同細(xì)胞系測(cè)試細(xì)胞毒性；通過(guò)倒置熒光顯微鏡、流式細(xì)胞分析技術(shù)等對(duì)藥物進(jìn)入纖維肉瘤細(xì)胞HT1080的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用小動(dòng)物活體成像技術(shù)考察藥物體系在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)的分布情況。結(jié)果：采用分子篩色譜純化可以得到純度相對(duì)較高的修飾產(chǎn)物，其毒性較無(wú)修飾的Gelonin強(qiáng)，且在HT1080細(xì)胞系作用最明顯；細(xì)胞攝取結(jié)果顯示，與未修飾的Gelonin相比，該藥物體系具有更高的細(xì)胞攝取效率；動(dòng)物成像結(jié)果表明，PEG5000修飾可以改變Gelonin在動(dòng)物體內(nèi)的分布情況，增加在腫瘤的藥物蓄積。結(jié)論：穿膜肽和PEG5000修飾后的Gelonin有較高的腫瘤細(xì)胞攝取和殺傷能力，藥物在腫瘤的蓄積量較高，從而增強(qiáng)了藥物的抑瘤效果。

核糖體失活蛋白；聚乙二醇；低分子量魚精蛋白；抗腫瘤；Gelonin

Gelonin是一種來(lái)源于植物、具有高效細(xì)胞殺傷效力的核糖體失活蛋白。一旦能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，只要極少分子的Gelonin便可以殺滅一個(gè)腫瘤細(xì)胞［1-2］。然而，同其他生物大分子藥物一樣，體內(nèi)穩(wěn)定性差、半衰期短以及細(xì)胞攝取效率低成為影響Gelonin抗腫瘤應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。細(xì)胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）介導(dǎo)大分子給藥是近年來(lái)蛋白藥物的研究熱點(diǎn)。CPPs是一類富含精氨酸或賴氨酸的多肽，序列一般少于20個(gè)氨基酸。通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)、基因重組等手段可以將穿膜肽與包括細(xì)胞毒素在內(nèi)的蛋白連接，介導(dǎo)后者入胞。低分子量魚精蛋白（low molecular weight protamine，LMWP）是從經(jīng)嗜熱菌蛋白酶處理的天然魚精蛋白酶解產(chǎn)物中分離得到一個(gè)多肽［3-6］，由Yang教授的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，是目前研究較廣泛的穿膜肽。體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)表明，LMWP沒(méi)有免疫原性，是安全性較好的細(xì)胞穿膜肽［7-8］。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾是在1977年由Abuchowski等［9-10］發(fā)展的一種蛋白修飾方法，主要用于提高蛋白的穩(wěn)定性及體內(nèi)半衰期。

1 材料與方法

1.1 蛋白的分離與純化重組Gelonin蛋白的C端通過(guò)酰胺鍵與LMWP的N端半胱氨酸上的氨基偶聯(lián)，然后將末端含有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的PEG5000-Mal與Gelonin-LMWP末端半胱氨酸的巰基進(jìn)行反應(yīng)，從而得到蛋白修飾產(chǎn)物。采用快速蛋白液相色譜（flow protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）的Superdex 75（GE Healthcare）分子篩柱將連接產(chǎn)物提純。先后用20％的乙醇和超純水以0.3 mL/min流速?zèng)_洗預(yù)裝柱20 min后，用流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行柱平衡，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。基線到達(dá)平衡后，將樣品（0.22 μmol濾膜過(guò)濾）推入1 mL上樣環(huán)內(nèi)，控制FPLC的七通閥將樣品注入柱內(nèi)，進(jìn)行分離純化。

利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)收集產(chǎn)物的純度進(jìn)行鑒定。將FPLC純化后所收集的兩個(gè)吸收峰的收集液分別用10 kDa的超濾管（美國(guó)Merk Millipore公司）超濾濃縮至1 mL。分別取10 μL濃縮液加入2.5 μL加樣緩沖液后，沸水浴煮樣10 min變性蛋白。以每孔5 μL的量上樣到10％的SDS聚丙烯酰胺凝膠膠孔。以80 V電壓跑膠150 min后，用固定液（10％乙酸和2.5％異丙醇的水溶液）固定凝膠3 min，考馬斯亮藍(lán)染色3 h后用洗脫液（10％乙酸）洗脫，5 h后拍攝。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞與人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的培養(yǎng)液為DMEM基本培養(yǎng)基加10％FBS（胎牛血清）。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞與人宮頸癌HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液為RPIM1640培養(yǎng)基加10％FBS。所有細(xì)胞均在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞毒性測(cè)試?yán)肕TT法對(duì)核糖體失活蛋白在HT1080、U87、MCF-7和HeLa 4種腫瘤細(xì)胞中的毒性進(jìn)行檢測(cè)。將細(xì)胞以5×103的孔密度接種到96孔板中，上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12 h后分別將Gel（即Gelonin）、Gel-LMWP-PEG5000加入細(xì)胞，終濃度為10-9至10-5mol/L。37℃恒溫培養(yǎng)72 h后，將孔內(nèi)培養(yǎng)基輕輕吸出，加入100 μL含有5‰MTT溶液的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，輕輕吸出孔內(nèi)所有液體并加入200 μL DMSO（二甲基亞砜），室溫震搖孵育至孔底無(wú)紫色不溶物。最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在OD490 nm和OD650 nm的吸收波長(zhǎng)，利用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

使用Prism軟件計(jì)算各種細(xì)胞的IC50（半數(shù)抑制濃度）并繪制曲線。

1.4 腫瘤動(dòng)物模型建立取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT1080細(xì)胞消化后離心，棄去上清后用PBS吹洗并離心。用一定量PBS重懸細(xì)胞后，以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。將待接種裸鼠（Balb/C nude）放入生物安全柜的麻醉裝置中，加入異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。用75％酒精棉球擦拭待接種部位后，用無(wú)菌注射器將200μL細(xì)胞懸液（約107個(gè)細(xì)胞）注入皮下。待腫瘤體積約150mm3，使用該腫瘤模型動(dòng)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 熒光標(biāo)記

1.5.1 FITC標(biāo)記稱取一定量的FITC（異硫氰酸熒光素）粉末溶于無(wú)水DMSO中，使終濃度為50 mmol/L。將充分溶解的FITC以摩爾比1∶5（蛋白∶FITC）緩慢滴加入蛋白溶液，反應(yīng)體系為pH 7.4的PBS緩沖液，置于4℃，輕搖反應(yīng)過(guò)夜。利用FPLC脫鹽柱（GE Healthcare，流動(dòng)相為PBS，流速為1 mL/ min）除去游離FITC。將標(biāo)記后的蛋白冷凍干燥，加入1 mL PBS復(fù)溶凍干樣品，BCA法測(cè)量蛋白濃度。

1.5.2 CY5標(biāo)記稱取一定量NHS-CY5（N-羥基琥珀酰亞胺修飾的三氫-吲哚菁型染料）粉末溶于無(wú)水DMSO中，使終濃度為30 mmol/L。將充分溶解的CY5以摩爾比1∶3（蛋白藥物∶CY5）緩慢滴加入蛋白溶液，反應(yīng)體系為pH 7.4的PBS緩沖液，4℃震搖反應(yīng)過(guò)夜。利用FPLC脫鹽柱（GE Healthcare，流動(dòng)相為PBS，流速為1 mL/min）除去游離CY5。將標(biāo)記蛋白冷凍干燥，加入1 mL PBS復(fù)溶凍干樣品，并用BCA法測(cè)量蛋白濃度。

1.6 細(xì)胞攝取

1.6.1 細(xì)胞攝取觀察利用倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，IX81）觀察人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞對(duì)藥物體系的攝取情況。將細(xì)胞以5×104的孔密度接種到24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將FITC標(biāo)記的Gelonin、Gelonin-LMWP-PEG5000分別以5 μmol/L的終濃度加入孔中，37℃培養(yǎng)3.5 h后，加入Hochest 33342（終濃度為5 μg/mL）避光孵育20 min。棄掉培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗后，用臺(tái)盼藍(lán)在37℃下孵育10 min以淬滅胞外熒光。PBS洗凈臺(tái)盼藍(lán)后加入4％多聚甲醛，37℃下固定10 min，PBS洗凈后，采用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.6.2 細(xì)胞攝取定量檢測(cè)利用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司，F(xiàn)ACS Calibur）對(duì)人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞對(duì)藥物體系的攝取情況進(jìn)行定量考察。具體做法如下：將細(xì)胞以2×105的孔密度接種到6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將FITC標(biāo)記的Gelonin、Gelonin-LMWP-PEG5000分別以5 μmol/L的終濃度加入孔中，37℃培養(yǎng)4 h后消化并收集細(xì)胞，離心后用PBS重懸，重復(fù)3次，洗去細(xì)胞表面的熒光物質(zhì)和殘余培養(yǎng)基、胰酶等。最后用1 mL PBS重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.7 動(dòng)物成像用1％戊巴比妥鈉按照8.5 g/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉小鼠。待小鼠不再自主活動(dòng)后立即用小動(dòng)物活體成像儀（PekingElmer）進(jìn)行成像。分別向各組中的3只小鼠尾靜脈注射CY5標(biāo)記后的Gelonin、Gelonin-LMWP-PEG5000，于10 min、1 h、3 h、6h、12 h、24 h等特定時(shí)間點(diǎn)拍攝其組織分布情況。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化采用FPLC蛋白純化系統(tǒng)可以得到純度較高的Gelonin修飾產(chǎn)物。根據(jù)修飾前后蛋白體系分子量的變化，利用Superdex75分子篩預(yù)裝柱純化修飾產(chǎn)物，分別在約40 min、46 min時(shí)得到兩個(gè)較高的吸收峰。SDS聚丙烯酰胺凝膠結(jié)果顯示，出現(xiàn)的第1個(gè)峰為分子量較大的PEG5000修飾產(chǎn)物，條帶位置在44 kDa（PEG修飾后的蛋白在凝膠中會(huì)出現(xiàn)拖尾和位移，所處的條帶位置并非分子量直接疊加）；峰2主要為未經(jīng)PEG5000修飾的蛋白（圖1）。

圖1 蛋白藥物的純化及鑒定Fig 1Purification and identification of toxin

2.2 細(xì)胞毒性采用MTT法檢測(cè)了修飾后的蛋白藥物體系對(duì)HT1080、U87、MCF-7和HeLa 4種腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果顯示，與未修飾Gelonin比較，修飾蛋白的細(xì)胞毒作用有所增強(qiáng)，在4種細(xì)胞系中的IC50均有所降低；其中，HT1080對(duì)蛋白毒素較為敏感，其IC50最低，未修飾蛋白與修飾蛋白的IC50分別為2.69 μmol/L、0.22 μmol/L（圖2、3，表1）。

圖2 藥物在不同細(xì)胞系中的MTT毒性測(cè)試Fig 2Toxicity of protein drugs in different cell lines

圖3 不同細(xì)胞系中修飾前后蛋白藥物的IC50值比較Fig 3Comparison of IC50value between native and modified toxins in different cell lines

2.3 細(xì)胞攝取

2.3.1 定性觀察利用倒置熒光顯微鏡拍攝HT1080細(xì)胞對(duì)蛋白藥物的攝取情況。結(jié)果顯示，采用LMWP和PEG5000修飾蛋白處理的細(xì)胞，其綠色熒光明顯強(qiáng)于未修飾蛋白組，說(shuō)明修飾后的蛋白毒素藥物體系進(jìn)入HT1080細(xì)胞的能力增強(qiáng)（圖4）。

表1 修飾前后的蛋白藥物在4種細(xì)胞系中的IC50值Tab 1IC50values of the toxins in different cell lines with or without modification

圖4 HT1080細(xì)胞對(duì)蛋白藥物的攝取Fig 4Cellular uptake of toxins in HT1080

2.3.2 定量檢測(cè)利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測(cè)HT1080細(xì)胞對(duì)核糖體失活蛋白的攝取能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)LMWP和PEG5000修飾后的蛋白，平均熒光強(qiáng)度及熒光強(qiáng)度中位數(shù)顯著高于未修飾組（修飾后蛋白體系的平均熒光強(qiáng)度是未修飾蛋白的58.9倍，熒光中位數(shù)為64.2倍），表明了修飾蛋白在HT1080細(xì)胞的攝取效率有顯著地提高（圖5、6）。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HT1080對(duì)蛋白藥物攝取結(jié)果Fig 5FACS results of cellular transduction of toxins in HT1080 cell line

圖6 修飾前后的蛋白藥物在HT1080中熒光強(qiáng)度對(duì)比圖Fig 6Comparison of fluorescence intensity between native and modified toxins in HT1080 cell line

2.4 動(dòng)物體內(nèi)分布采用小動(dòng)物成像技術(shù)對(duì)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的分布進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未修飾的Gelonin在動(dòng)物腎臟內(nèi)熒光強(qiáng)度較高，腎臟蓄積非常明顯，且腫瘤內(nèi)幾乎沒(méi)有熒光；而經(jīng)LMWP 與PEG5000修飾后的蛋白藥物在12 h時(shí)腫瘤中出現(xiàn)熒光，24 h時(shí)腎臟累積消失，同時(shí)有明顯的腫瘤聚積。未修飾的藥物在動(dòng)物體內(nèi)3 h時(shí)的總熒光強(qiáng)度最高，而修飾后藥物組的最強(qiáng)總熒光強(qiáng)度則出現(xiàn)在12 h。這些結(jié)果提示PEG化延長(zhǎng)了藥物的長(zhǎng)循環(huán)作用，減少了藥物在腎臟的蓄積，提高了蛋白藥物在腫瘤的累積（圖7）。

圖7 蛋白藥物在HT1080荷瘤小鼠體內(nèi)的分布Fig 7In-vivo distribution of toxins in HT1080 tumor-bearing animal model

3 討論

核糖體失活蛋白Gelonin的作用機(jī)制是通過(guò)切除位于真核細(xì)胞28S亞基核糖體RNA中保守sarcin/ricin環(huán)的特殊位點(diǎn)A-4324的腺嘌呤，令核糖體失活，通過(guò)終止核糖體的蛋白質(zhì)生物合成功能而殺死真核細(xì)胞［11-12］。其殺傷細(xì)胞的效率非常高，因此，可以成為治療腫瘤的生物大分子藥物。

CPPs不僅能攜帶小分子的化學(xué)藥物入胞，還可以介導(dǎo)核酸、蛋白、脂質(zhì)體、高分子聚合物和無(wú)機(jī)納米材料等穿越細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞［13］。CPPs介導(dǎo)大分子或納米載體轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞基本不受細(xì)胞類型的影響，對(duì)包括腦部在內(nèi)的絕大部分器官或組織的細(xì)胞均有效［14］。穿膜肽與蛋白的連接方式主要有化學(xué)偶聯(lián)（即共價(jià)連接）、基因重組、靜電吸附（即非共價(jià)連接）和蛋白載體表面修飾等［15］。所連接的蛋白種類也十分廣泛：生長(zhǎng)因子、胰島素、酶類、細(xì)胞毒素、抗體等。因此，穿膜肽技術(shù)被形象地比喻為“特洛伊木馬”［16］。在腫瘤的診斷與治療方面，Shin等［17-18］通過(guò)靜電吸附作用將肝素修飾的癌胚抗原單克隆抗體與穿膜肽修飾的蛋白毒素形成具有靶向性的藥物復(fù)合物；Reilly團(tuán)隊(duì)將TAT連接于抗EGF誘導(dǎo)的p21抗體上，用于進(jìn)行乳腺腫瘤的診斷［19-21］；Harada等［22］構(gòu)建了一種由穿膜肽Tat、氧依賴降解域ODD和凋亡酶原pro-Caspase-3構(gòu)成的融合蛋白，這種蛋白在缺氧條件下具有穩(wěn)定性，pro-Caspase-3可被激活成Caspase-3，從而激活細(xì)胞凋亡；該體系還應(yīng)用于腫瘤抑制蛋白P53，所形成的TAT-ODD-P53融合蛋白在體外實(shí)驗(yàn)中顯示了促進(jìn)H1299細(xì)胞凋亡的作用，在荷瘤小鼠體內(nèi)也發(fā)揮了明顯的抑瘤作用［23-24］。

聚乙二醇化（PEGylation）是蛋白的常用修飾方法之一。PEG不僅自身具有免疫惰性，還可以通過(guò)遮蔽蛋白表明的抗原決定簇或阻止抗原與抗體的結(jié)合而抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生，且通過(guò)穩(wěn)定蛋白構(gòu)象、增加蛋白分子量、遮擋蛋白等作用，使PEG化后蛋白的生物化學(xué)性質(zhì)更趨穩(wěn)定，同時(shí)阻礙蛋白被蛋白酶水解，延長(zhǎng)蛋白的體內(nèi)半衰期，降低其在體內(nèi)的血漿清除率和免疫原性。

本研究通過(guò)蛋白純化、毒性檢測(cè)、細(xì)胞攝取和小動(dòng)物成像等實(shí)驗(yàn)，對(duì)Gelonin-LMWP-PEG5000進(jìn)行表征和研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用FPLC蛋白純化系統(tǒng)的分子篩對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行純化后，可以得到純度相對(duì)較高的Gel-LMWP-PEG5000；在對(duì)修飾前后蛋白毒素在不同細(xì)胞系中的毒性進(jìn)行探究后發(fā)現(xiàn)，人纖維肉瘤HT1080對(duì)毒素最為敏感，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用HT1080細(xì)胞株進(jìn)行。在細(xì)胞攝取方面，細(xì)胞穿膜肽（低分子量魚精蛋白）可以高效的攜帶蛋白毒素進(jìn)入HT1080細(xì)胞；由于所修飾的PEG5000為長(zhǎng)鏈狀，蛋白與PEG5000的修飾比例為1∶1，LWMP/PEG5000與Gelonin蛋白呈現(xiàn)“Y”字型結(jié)構(gòu)，穿膜肽介導(dǎo)藥物體系進(jìn)入細(xì)胞的能力得到了明顯地提高。此外，PEG修飾可提高蛋白藥物在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，從而也有利于更多的藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。動(dòng)物成像實(shí)驗(yàn)表明，雖然PEG5000修飾后的產(chǎn)物在腎臟仍有一定的積累，但蓄積量明顯減少，而分布在腫瘤部位的藥量明顯增加，從而提高了蛋白毒素在腫瘤部位的生物利用度。

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（2015-04-17收稿）

Study on cell-penetrating peptide modified and PEGylated ribosome inactive protein Gelonin

ZHANG Ya-jie1，2，WANG Hui-yuan2，CHEN Ying-zhi2，TANG Yi-si2，3，YANG Victor C1，4，HUANG Yong-zhuo2
（1.Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnosis，School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2.Shanghai Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China；3.Teopical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；4.College of Pharmacy，University of Michigan，Michigan 48109，USA）

Objective：To improve anti-tumor effect of Gelonin，the plant-sourced RIP is modified by chemically conjugating a cellpenetrating peptide and polyethylene glycol（PEG）.Methods：Purified protein was obtained after being performed on FPLC（fast protein liquid chromatography）Superdex75 column.Cytotoxicity was detected by MTT assay.The cellular uptake by HT1080 cells was studied by using inverted fluorescence microscopy and flow cytometry.In-vivo imaging technology was utilized for investigation of the in-vivo drug distribution in the HT1080 tumor-bearing mice.Results：The modified product was purified by using gel filtration chromatergraphy. Moreover，compared with native Gelonin，the cytotoxicity of modified protein was increased，especially in HT1080，presumably due to the enhanced cellular uptake.The in-vivo imaging results suggested that drug accumulation in tumor was improved by PEGylation. Conclusion：Modified Gelonin can improve cellpenetration and cytotoxicity in tumor cells.PEGylation can increase tumor accumulation of the protein drug，and thereby enhance its anti-tumor effect.

ribosome inactivating protein；polyethylene glycol；low molecular weight protamine；anti-tumor；Gelonin

R9

A

1006-8147（2015）05-0369-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172996，81373357，8136 1140344，81422048）

張婭潔（1988-），女，碩士在讀，研究方向：藥劑學(xué)；通信作者：楊志民，E-mail：vcyang@med.umich.edu；黃永焯，E-mail：yzhuang@ simm.ac.cn。