酮病和健康奶牛血清中觸珠蛋白和血清淀粉樣蛋白A濃度的比較研究

郝景鋒，王建國，朱曉巖，楊文濤，丁洪巖，史曉霞，宋玉祥，鄧清華，趙晨旭，劉兆喜，王 力，趙 權，劉國文

（1.吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林132101；2.吉林農業大學研究生院，吉林 長春130118；3.吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春130062）

急性期反應蛋白（acute phase serum protein response，APP）是一類公認的炎癥、外傷以及其他病理學狀態的指示蛋白，這類蛋白對于家畜健康狀態的監測是十分重要的，并且已經受到廣泛關注［1］。急性期反應蛋白的生物學功能包括：抑制蛋白酶的活性；清除異物以及壞死組織；促進自由基排出；促進細胞修復，增強細胞趨化性，促進吞噬作用等［2］。國外研究表明，在炎癥的急性階段，血清中急性期反應蛋白的濃度能從2、3倍迅速增至數百倍［3］。觸珠蛋白（haptoglobin，HP）和血清淀粉樣蛋白 A（serum amyloid A，SAA）是大多數動物最主要的急性期反應蛋白。

奶牛酮病是以能量負平衡、脂肪動員、肝內脂肪攝入過多為主要病理學基礎，以低血糖、高血酮為主要血液生化特點的營養代謝性疾病，引起體內糖和脂肪代謝紊亂，目前的研究初步認為，酮病的發生對肝臟會產生不同程度的損傷，但有關酮病奶牛血清中HP和SAA有何變化至今尚未報道。

本試驗運用ELISA方法，旨在通過對酮病奶牛和健康奶牛血清中觸珠蛋白和淀粉樣蛋白A濃度測定，為更加深入地研究奶牛酮病發病機制并對該病做出及時診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間、地點 2012年9月于長春市某奶牛場取樣，在實驗室內進行分析。

1.2 試驗材料

1.2.1 奶牛選擇及分組 長春市某奶牛養殖場，采用配對比較的方法，將胎次、產奶量、年齡以及體況相近荷斯坦奶牛20頭分為2組，以血清中β－羥丁酸 （BHBA）、葡萄糖（Glucose）和非酯化脂肪酸（NEFA）濃度作為奶牛酮病的診斷依據（BHBA＞1.2mmol/L；glucose＜2.5mmol/L；NEFA＞0.5 mmol/L），最終選定10頭奶牛為酮病組，另外選擇10頭奶牛作為對照組（健康組）。日糧配給按照圍產期奶牛營養需要標準供應，TMR飼養技術飼喂。

1.2.2 主要試劑與儀器 牛觸珠蛋白相關蛋白ELISA試劑盒（產品編號：E11H0103），上海藍基生物科技有限公司；牛血清淀粉樣蛋白A ELISA試劑盒（產品編號：E11S0228），上海藍基生物科技有限公司；7170A全自動生化分析儀，日本 HITACHI公司。TGL－16C型臺式高速離心機，上海安亭科學儀器廠；酶標儀為美國Bio－TEK 產品，型號為ELX800；電子天平購自日本SHIMADZU。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 清晨飼喂前通過頸靜脈采集血液樣品，血樣在室溫中靜置40min，3 000r/min離心15min，收集血清，于－20℃冰箱保存待測血清中的HP和SAA含量。

1.3.2 病牛的檢測 參照王建華方法配制酮粉［4］，即亞硝基鐵氰化鈉1g，硫酸銨20g，無水碳酸鈉20g。按以上比例準確稱量各試劑分別研細，充分混合后干燥保存。操作時取上述粉末少許在載玻片上，加乳汁1滴，如出現紫色為陽性反應。

1.3.3 血樣 β－羥丁酸、非酯化脂肪酸和葡萄糖含量采用β－羥丁酸檢測試劑盒、血液非酯化脂肪酸測定試劑盒和葡萄糖測試試劑盒測定，按試劑盒說明書操作。

1.4 臨床酮病的診斷標準 本試驗在現場采用酮粉法對牛乳汁進行初步檢測，對受試牛頸靜脈采集血樣。酮粉法檢測的結果判定根據顏色變化，顏色無變化視為陰性，變紫色者初步確定為陽性。本試驗酮病奶牛的判定標準為血清中：BHBA＞1.2 mmol/L；glucose＜2.5mmol/L；NEFA ＞0.5 mmol/L［5］。

1.5 數據統計分析 應用SPSS 13.0軟件分析數據，酮病奶牛和健康奶牛血清中各指標的分析用ONE－WAY ANOVA（方差分析），試驗結果用±SD表示。

2 結果

2.1 奶牛胎次、體重和產奶量 所選擇的奶牛胎次相當，符合試驗要求，酮病奶牛體重和產奶量顯著低于健康奶牛（P＜0.05）。見表1。

表1 酮病和健康奶牛胎次、體重和產奶量 （mean±SD）

2.2 血清中BHBA、NEFA和血糖含量 如表2所示，與健康奶牛相比，血清中BHBA和NEFA濃度顯著高于健康奶牛（P＜0.05）；血清中葡萄糖濃度顯著低于健康奶牛（P＜0.05）。

表2 酮病和健康奶牛血清中BHBA、NEFA和血糖濃度測定結果 （mean±SD）

2.3 血清中HP和SAA含量測定結果 如圖1顯示，酮病奶牛血清中HP和SAA濃度均極顯著高于對照組健康奶牛（P＜0.01）。

3 討論

根據試驗結果可以看出（圖1），酮病奶牛的HP濃度顯著高于健康奶牛，表明酮病發生時能夠促進觸珠蛋白的生成，觸珠蛋白又稱結合珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白［6］，主要存在于多數哺乳動物、人類的血液以及其他體液中，能夠與游離的血紅蛋白（Hb）相結合，形成 HP－Hb復合物，該復合物由于分子量較大，不能透過腎小球濾膜而經尿液排出，故可保護亞鐵血紅素防止其漏失，從而避免由于溶血導致的腎臟受損。觸珠蛋白作為一種急性期反應蛋白，在參與機體抗感染、損傷組織的修復以及維持內環境穩定等方面起著重要作用［7］。近年研究結果表明，觸珠蛋白與肝臟疾病聯系密切，因此觸珠蛋白日益成為廣大肝病研究者研究的重點，觸珠蛋白的表達主要受白介素－6（IL－6）的調節，當奶牛由于酮病對機體產生應激，內毒素刺激白細胞產生白介素－1（IL－1）和白介素－6（IL－6），IL－1能夠促進胰高血糖素以及糖皮質激素分泌增加，其中胰高血糖素能夠增強細胞的環腺苷酸水平，使肝臟的合成功能增強，而IL－6也能促進觸珠蛋白的合成，肝細胞膜存在大量觸珠蛋白受體，與之相結合，從而促進其合成。觸珠蛋白由于含有不同類型的輕鏈，具有遺傳多態性，在肝臟合成和降解，并受前列腺素、激素以及細胞因子等的調節，具有廣泛的生物學功能，可能是一種重要的調節蛋白。

另外，結果表明，酮病奶牛的SAA濃度相比健康奶牛顯著升高，可見酮病能夠促進血清淀粉樣蛋白A的產生，血清淀粉樣蛋白是由同一簇基因編碼的一組多形性蛋白，它們存在于各種禽類和哺乳動物血液中。作為一種肝臟來源的高密度脂蛋白（HDL）相關載脂蛋白，血清中SAA的濃度可在對各種損傷包括創傷、炎癥、感染以及腫瘤時升高1 000倍。SAA主要由肝細胞合成，當酮病發生時，肝臟不同程度受到損傷，在應激條件下，巨噬細胞釋放的白細胞介素（IL）－1和腫瘤壞死因子（TNF）使IL－6分泌增加，后者刺激肝細胞產生急性時相蛋白，且受糖皮質激素調控，大量的SAA可以用替換載脂蛋白A－Ⅰ與高密度脂蛋白（HDL）相結合，從而形成SAA/HDL復合體，而HDL可以運輸膽固醇，因此酮病造成的膽固醇增加可以促進血清中SAA濃度增高。綜上所述，奶牛發生酮病時作為急性期蛋白的觸珠蛋白以及淀粉樣蛋白A的濃度在應激作用下顯著升高，提示在奶牛發生酮病時可能存在炎癥反應等急性過程，進一步研究還需對其機理進行深入研究。

［1］ Kushner lière′s clinical rheumatology［J］.1994，8（3）：513－530.

［2］ 王璇，李愛敏，初清.感染性疾病急性期反應蛋白的研究進展［J］.山東醫藥，2010（45）：105－106.

［3］ Heegaard Pmh，Godson D L，TOUSSAINT MJM，etal.The acute phase response of haptoglobin and serum amyloid A（SAA）in cattle undergoing experimental infection with bovine respiratory syncytial virus［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2000，77（1）：151－159.

［4］ 王建華.獸醫內科學［M］.4版.北京：中國農業出版社，2010：228－229.

［5］ Li P，Li X，Fu S，etal.Alterations of fatty acidβ－oxidation capability in the liver of ketotic cows［J］.Journal of dairy science，1995（4）：1759－1766.

［6］ 楊宇，李慶章，呂英.結合珠蛋白在奶牛乳房炎研究中的進展［J］.中國奶牛，2010（10）：47－49.

［7］ 譚麗娜，黃進華.結合珠蛋白的研究進展［J］.國際病理科學與臨床雜志，2006（1）：43－47.