雞胚脾臟石蠟切片制作及H.E.染色方法改良的探討

王 鐵，王子旭，陳耀星

（中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193）

石蠟切片和H.E.染色，是組織學的最基本的技術之一，至今已使用了100多年［1］。石蠟切片是目前組織標本制作的方法之一，其特點是可進行多種染色，細胞及組織層次感好，且能長期保存完好的組織形態［2］。石蠟切片制作和染色過程中涉及的因素很多［3］，各個環節均需要操作者根據所制作的組織不同嚴格篩選試驗條件［4］。已有大量文章進行石蠟切片方法學的研究，如組織固定不充分，會導致切片灰染［5］，脫蠟不徹底導致染色不良［6－7］，伊紅復染時，要根據使用次數調節復染的時間［8］等，但并沒有專門針對胚胎組織石蠟切片制作方法探討的相關文章。本文選取脾臟為代表器官，目的是通過摸索制作雞胚脾臟石蠟切片中脫水、透明、浸蠟、切片與染色的最佳條件，探討制作優質雞胚組織石蠟切片的方法。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取 選用AA肉雞受精卵16枚進行孵化，孵化期采用人工智能控溫控濕，溫度保持為37℃，濕度為50%～60%。分別在15胚齡（E15）和21胚齡（E21）摘取完整的雞胚脾臟（n＝8）。取材后用4%多聚甲醛固定。

1.2 石蠟切片制作試驗 雞胚脾臟組織較小（約0.02g，最大直徑約2mm），無需修塊，整體脫水包埋。根據雞胚胚齡的不同，分別設立四種脫水及透明方法，把脫水及透明分為進入乙醇濃度95%前和進入乙醇濃度95%后兩個階段，每個階段分為快組（F）和慢組（S），每個胚齡共分為前快后快（F/F）、前慢后快（S/F）、前快后慢（F/S）和前慢后慢（S/S）四組。脫水、透明及浸蠟時間按照時間設置操作如表1所示。石蠟切片機切片，厚度為3～4μm，展片機水浴展片并烤干，常規H.E.染色。

表1 雞胚脾臟脫水、透明、浸蠟流程

1.3 H.E.染色試驗 根據最佳脫水及透明時間制作石蠟切片；脫蠟至水；室溫20℃以上，用蘇木精分別浸染20min、45min、3.5h；分色及藍化，其中染色3.5h的一組用兩次分色法，即短暫分色一次后自來水藍化10min，然后二次分色至細胞質無色；常規脫水，伊紅浸染，封片。

2 結果與分析

2.1 石蠟切片制作試驗結果 15胚齡的雞胚脾臟，前階段低濃度乙醇脫水時間對切片質量影響不大。后期高濃度乙醇脫水及二甲苯透明的時間較短為好（見中插彩版圖1B），時間較長組織因過度脫水，組織收縮嚴重，體積明顯縮小，因過度失水導致組織變脆、切片有龜裂現象且著色較淺（見中插彩版圖1CD）。21胚齡的雞胚脾臟，前階段低濃度乙醇脫水時間較長為好，時間過短則導致組織脫水不徹底，因影響了后期的透明和浸蠟，鏡下細胞結構受損，透明時因二甲苯吸水作用較大，組織皺縮并出現龜裂現象（見中插彩版圖1EG）。后期高濃度脫水及二甲苯透明時間較長為好（見中插彩版圖1F），時間較短則透明不夠，石蠟浸潤不均勻，著色效果不好（見中插彩版圖1H）。

2.2 H.E.染色試驗結果 因胚胎細胞著色效果差，蘇木精浸染20min、45min、均難以達到理想效果，經蘇木精浸染3.5h并使用兩次分色后，效果較為明顯（見中插彩版圖2）。

3 討論

胚胎組織與生長期組織有一定區別，胚胎細胞多處于有絲分裂期，細胞核大且H.E.染色時蘇木精著色效果較差。有研究表明，可將切片脫蠟至水后進行加熱處理，可以改善著色效果［9］。但加熱有可能改變組織抗原，進而影響免疫組化的效果。有研究表明，延長染色時間或加溫染蘇木素，再經2次或2次以上分色可提升染色效果［10］。本試驗發現，蘇木精浸染20min、45min，均難以達到理想效果，經蘇木精浸染3.5h并使用兩次分色后，效果較為明顯。胚胎組織含水量大，組織塊柔軟細嫩，脫水時間不宜過長，常規脫水方法會導致組織變硬［11］，過分脫水會導致組織萎縮、變脆、龜裂［12］。本試驗從30%酒精開始脫水，并適當縮短了脫水及透明的時間，并與常規脫水、透明的方法作比較，發現在雞胚15胚齡高濃度乙醇脫水及二甲苯透明的時間較短為好，時間較長組織因過度脫水，組織收縮嚴重，體積明顯縮小，組織因過度失水而變脆、切片有龜裂現象且著色較淺；雞胚21胚齡時低濃度乙醇脫水時間較長為好，時間過短則導致組織脫水不徹底，因影響了后期的透明和浸蠟，鏡下細胞結構受損，透明時因二甲苯吸水作用較大，組織皺縮并出現龜裂現象。后期高濃度乙醇脫水及二甲苯透明時間較長為好，時間較短則透明不夠，石蠟浸潤不均勻，著色效果不好。

［1］ 閆國和，古德全，林遠，等.制作鼠組織優質石蠟切片方法的探討［J］.第三軍醫大學學報，2002，24（7）：876－877.

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