糖尿病大鼠陰莖組織中糖基化終產(chǎn)物、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達分析

楊 超 丁永學(xué) 孔垂?jié)?刻校吾 張閣均

1.遼陽市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧遼陽 111000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110000

糖尿病大鼠陰莖組織中糖基化終產(chǎn)物、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達分析

楊 超1丁永學(xué)1孔垂?jié)?刻校吾2張閣均2

1.遼陽市中心醫(yī)院泌尿外科，遼寧遼陽 111000；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，沈陽 110000

目的探討糖尿病大鼠陰莖組織糖基化終產(chǎn)物（AGEs）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達變化及它們表達的相關(guān)性。 方法64只雄性Wistar大鼠隨機分為糖尿病模型組（DM組）和對照組（NC組），各32只。在DM組大鼠模型制備成功后的4、8、12、20周，兩組各殺檢8只大鼠。使用免疫組織化學(xué)法觀察陰莖組織中AGEs、iNOS的表達定位同時分析其含量變化，使用Real-time PCR檢測陰莖組織中AGEs、iNOSmRNA的表達情況。結(jié)果大量AGEs和iNOS陽性細(xì)胞分別出現(xiàn)于4、8、12、20周DM模型大鼠陰莖組織內(nèi)，其累計光密度（IOD）值高于對照組，并隨病程進展而增高（P＜0.05，P＜0.01）。Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周AGEs和iNOS的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），DM模型大鼠陰莖組織AGEs和iNOSmRNA表達水平隨著病程進展逐漸增加（P＜0.01），且高于相同時間點的NC組（P＜0.01），Pearson相關(guān)分析顯示，DM大鼠陰莖組織AGEs與iNOS的表達水平呈顯著正相關(guān)（r=0.845，P＜0.01）。 結(jié)論高血糖狀態(tài)下，陰莖組織內(nèi)AGEs和iNOS的表達顯著增加并呈正相關(guān)，可能共同參與了DM陰莖損害的發(fā)生。

糖尿病；陰莖組織；糖基化終產(chǎn)物；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；大鼠

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種由于胰島素相對或絕對缺乏引起糖代謝異常的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，長期的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致患者出現(xiàn)心腦血管、腎、眼底等多器官的并發(fā)癥，其中勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是糖尿病常見并發(fā)癥之一，有報道糖尿病性ED發(fā)病率高達75%，較非糖尿病患者高3倍，并隨年齡的增長和病程的延長而明顯增加；10年以內(nèi)病史者，50%以上合并ED，且糖尿病性ED（DMED）患者比普通ED患者癥狀更為嚴(yán)重［1］。DMED的發(fā)病機制目前尚不清楚，本實驗采用免疫組織化學(xué)法和Real-time PCR動態(tài)觀察DM大鼠陰莖組織糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的變化及兩者的關(guān)系，初步探討DMED的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立與取材

將64只SPF級Wistar大鼠［雄性，2月齡，體質(zhì)量為（200±20）g，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供］隨機分入糖尿病（DM）組和正常對照（NC）組，每組各32只。禁食12 h后，以65 mg/kg的劑量向DM組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，購自Sigma公司）溶液，NG組注射同體積的枸櫞酸緩沖液。72 h后測尾靜脈血葡萄糖濃度＞16.7 mmol/L（羅氏診斷公司產(chǎn)品），并持續(xù)1周為模型成功。分別在實驗第4、8、16、20周末脫頸椎處死兩組大鼠各8只，消毒后切取陰莖組織，仔細(xì)分離表皮，剪除陰莖頭和陰莖腳部，留取海綿體組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備蠟塊。并同時留取各組大鼠的新鮮陰莖組織，置于TRIzol中，留作提取RNA。

1.2 免疫組織化學(xué)法

將制備的組織蠟塊使用切片機切片，厚度5μm，于42℃水浴展片，貼于載玻片上，65℃烤片2 h后，經(jīng)過二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，100%乙醇Ⅰ5min，100%乙醇Ⅱ5 min，90%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5min，梯度透明，然后枸櫞酸鈉緩沖液（10mmol，pH 6.0）中高壓鍋內(nèi)煮沸，上氣3 min后緩慢冷卻進行抗原修復(fù)，然后使用SP免疫組織化學(xué)試劑盒（福州邁新生物有限公司）進行染色。免疫組織化學(xué)所用抗體為兔抗大鼠多克隆AGEs抗體（天津醫(yī)大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）和兔抗大鼠iNOS型多克隆抗體（武漢博士德生物制品司），使用濃度分別為1∶500和1∶75稀釋。結(jié)果判定：光鏡下見組織切片細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。圖像分析：Meta Morph高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（美國UIC公司）對免疫組織化學(xué)切片隨機選取高倍視野，每張切片隨機選取10個視野（×400），對圖片陽性區(qū)域進行累計光密度值IOD量化測定。

1.3 Real-time PCR

取兩組大鼠的陰莖組織，根據(jù)Trizol法提取大鼠陰莖組織的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，用AGEs和iNOS的特異性引物檢測AGEs和iNOS的表達，引物序列（上海生工）如下：AGEs：sense5'-TCCCCCACAGTGTTTCACAGT-3'，anti-sense 5'-GTGGACCCAGCAGG CTATGT-3'，擴增長度為100 bp，iNOS：sense 5'-CA CGACCCAGACTTCAGAGTA-3'，anti-sense 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，擴增片段長度為339 bp，GAPDH：sense5'-AGAGGAGAGGAAGGCCCCAGA-3'，anti-sense 5'-GGCAAGGTGGGGTTATACAGG-3'擴增片段為239 bp，循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性2 min；94℃15 s，64℃40 s，40次循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AGEs在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

NC組大鼠在造模后4、8、12、20周，AGEs的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠陰莖海綿體組織于第4周可見大量的AGEs陽性細(xì)胞，隨著病程進展，8、12、20周DM模型大鼠AGEs的表達量逐漸增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各時間點DM組大鼠的AGEs陽性細(xì)胞累計光密度值明顯高于NC組（P＜0.01）（圖1、表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs的表達情況

表1 兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs累計光密度值的比較（±s）

表1 兩組大鼠陰莖海綿體組織AGEs累計光密度值的比較（±s）

與NC組同時間比較，*P＜0.01；4、8、12、20周DM組內(nèi)比較，#P＜0.01

組別 n 4周 8周 12周 20周NC組DM組88 2.159±0.186 2.718±0.290*#2.198±0.248 3.623±0.333*#2.292±0.316 4.210±0.402*#2.382±0.338 4.899±0.555*#

2.2 AGEsmRNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周AGEsmRNA的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠AGEsmRNA的表達逐漸增加（P＜0.01），且明顯高于NC組（P＜0.01）（圖2）。

圖2 AGEsm RNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

2.3 iNOS在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

NC組大鼠在造模后4、8、12、20周iNOS的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），DM模型大鼠陰莖海綿體組織于第4周可見大量的iNOS陽性細(xì)胞，隨著病程進展，8、12、20周DM模型大鼠iNOS的表達量逐漸增加（P＜0.01），且4、8、12、20周各時間點，DM組大鼠的iNOS陽性細(xì)胞累計光密度值高于NC組 （P＜0.05，P＜0.01）（圖3、表2）。

圖3 免疫組化檢測兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS的表達情況

表2 兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS累計光密度值的比較±s）

表2 兩組大鼠陰莖海綿體組織iNOS累計光密度值的比較±s）

與NC組同時間比較，*P＜0.05，#P＜0.01；4、8、12、20周DM組內(nèi)比較，▲P＜0.01

組別 n 4周 8周 12周 20周NC組DM組88 1.805±0.382 2.162±0.180*▲2.029±0.267 2.731±0.361#▲2.248±0.262 3.292±0.404#▲2.364±0.241 4.266±0.447#▲

2.4 iNOSmRNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組大鼠在造模后4、8、12、20周iNOSmRNA的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），DM模型大鼠iNOSmRNA的表達逐漸增加（P＜0.01），且明顯高于NC組（P＜0.01）（圖4）。

圖4 iNOSm RNA在DM模型大鼠陰莖組織中的表達

2.5 AGEs、iNOS的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，DM大鼠陰莖海綿體組織中AGEs、iNOS陽性細(xì)胞均隨著病程的延長逐漸增加，兩者累計光密度值之間呈顯著正相關(guān)（r=0.845，P＜0.01）（圖5）。

圖5 AGEs、iNOS的相關(guān)性分析

3 討論

陰莖解剖結(jié)構(gòu)完整及海綿體平滑肌舒張是陰莖勃起的關(guān)鍵。DMED的發(fā)病機制還不是很清楚，大多研究認(rèn)為與DM所致的血管、神經(jīng)及海綿體血竇內(nèi)皮等功能受損，影響陰莖海綿體平滑肌的舒張有關(guān)，導(dǎo)致陰莖ED［2-4］。近年來，一些研究顯示，一氧化氮-環(huán)磷酸鳥苷（NO-cGMP）、AGEs［5］等因素也在DMED的發(fā)生中具有重要作用。本研究通過動態(tài)觀察DM模型大鼠陰莖海綿體AGEs和iNOS的表達變化探討兩者在DMED發(fā)生過程中的機制。

AGEs是一種異質(zhì)性的復(fù)合物，DM時持續(xù)高血糖可導(dǎo)致體內(nèi)各種組織蛋白的非酶糖基化水平異常增高，使AGEs產(chǎn)量增高。Seftel等［6］發(fā)現(xiàn)，DM患者陰莖組織中AGEs含量較正常人高，而且主要沉積在DM患者陰莖海綿體組織和陰莖白膜膠原組織；大量實驗表明，AGEs通過氧化應(yīng)激引起陰莖血管、神經(jīng)病變以及NO等多種勃起神經(jīng)遞質(zhì)的改變，促進DMED的發(fā)生、發(fā)展［7］，這可能與AGEs和細(xì)胞膜表面受體RAGE相結(jié)合產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激活性氧簇ROS的生成有關(guān)。同時有研究顯示，給予AGE抑制劑或抗氧化治療可以改善DM大鼠的ED［8-10］。本研究中對造模后4、8、12、20周的大鼠陰莖組織AGEs蛋白及mRNA的表達進行動態(tài)觀察，結(jié)果顯示，隨著造模時間的延長，AGES蛋白及mRNA的表達水平逐漸增高，而且高于NC大鼠，進一步說明AGEs在DMED的發(fā)病過程中具有重要作用，與前面的結(jié)果相一致。

L-Arg-NO-cGMP通路是陰莖勃起的重要機制，其中NO的產(chǎn)生是平滑肌舒張的關(guān)鍵影響因素。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶，包括nNOS、eNOS和iNOS，其中nNOS和eNOS都在海綿體平滑肌舒張陰莖勃起中具有重要作用［11-12］，iNOS在正常、年輕的陰莖內(nèi)僅有少量表達，主要在病理情況下表達升高，在正常生理情況下對NO的生成發(fā)揮作用較少［13］。Podlasek等［14］的研究表明，DM大鼠陰莖組織中nNOS和eNOS表達較正常大鼠低，而iNOS表達則高于正常大鼠。本研究結(jié)果顯示，造模后4、8、12、20周的大鼠陰莖組織iNOS蛋白及mRNA的表達水平隨著造模時間的延長逐漸增高，而且AGEs的表達水平與iNOS呈正相關(guān)，提示可能AGEs和iNOS通過某種聯(lián)系在DMED過程中發(fā)揮作用。

有報道顯示，一定環(huán)境中AGEs能促進iNOS表達［15］；Chang等［16］發(fā)現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞中AGEs通過p38MAPK依賴信號通路增強iNOs活性，催化生成過量的NO；Wang等［17］發(fā)現(xiàn)，AGEs誘導(dǎo)iNOS在鼠類小膠質(zhì)細(xì)胞岬N-11中表達，促進了阿爾海默病的發(fā)生，因此本研究可能提示在DMED的發(fā)生過程中可能是長期的高血糖狀態(tài)下AGEs表達增加，并誘導(dǎo)陰莖海綿體組織中iNOS的表達，造成過量的NO在組織中積聚。DM氧化應(yīng)激狀態(tài)下生成的大量ROS可與NO生成過氧化亞硝酸鹽陰離子（ONOO-），消耗大量NO，降低了NO相對有效濃度［18-20］，從而影響了陰莖海綿體平滑肌的舒張功能，導(dǎo)致了DMED，而且AGEs 與iNOS的相互作用過程中產(chǎn)生大量的ROS、NO、ONOO-，可有細(xì)胞毒作用，通過多種途徑介導(dǎo)陰莖組織細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）凋亡，影響陰莖的勃起功能。

綜上所述，AGEs與iNOS的內(nèi)在聯(lián)系可能從一個全新的角度闡述DMED的發(fā)病機制，即高糖環(huán)境誘導(dǎo)陰莖組織AGEs表達增高，AGEs增加陰莖海綿體組織iNOS的量與活性，通過氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、降低NO利用率等途徑參與DMED的發(fā)生、發(fā)展，但是這種機制具體的發(fā)生過程還需要進一步通過加大樣本量和相關(guān)指標(biāo)的檢測進行確認(rèn)。

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The exPression analysis of AGEs and iNOS in Penile tissue of rats with diabetes mellitus

YANG Chao1DING Yong-xue1KONG Chui-ze2LIU Xiao-wu2ZHANG Ge-jun2
1.Department of Urology，Liaoyang Central Hospital in Liaoning Province，Liao yang 111000，China；2.Department of Urology，the First Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110000，China

Objective To study the change of the expressions of advanced glycation end products（AGEs）and inducible nitric oxide synthase （iNOS）in penile tissue of rats with diabetes mellitus and the relationship of the expressions of AGEs and iNOS.Methods 64maleWistar ratswere distributed randomly into the diabeticmodel group（the DM group）and the control group （the NC group），and therewere 32rats in each group.After 4，8，12 and 20 weeks DM models being successfully prepared，8 rats in both groupswere killed.Change of the expression and localization of AGEs and iNOS in penile tissuewere observed and its change of contentwas analyzed by immunohistochemicalmethod，and the expression of AGEs and iNOSmRNA in penile tissue was detected by Real-time PCR.Results A large number of AGEs and iNOSpositive cells appeared in the penile tissue of themodel ratswith diabetes mellitus at 4，8，12 and 20 weeks respectively，the integrated option density （IOD）of these cellswere higher than those of the cells in the control group and the IOD value gradually degraded with the progression of disease （P＜0.05，P＜0.01）.Real-time PCR results show that after 4，8，12 and 20 weeksmodeling，there was no statistical difference of the AGEs and iNOSexpression of rats in NC group （P＞0.05），and the AGEs and iNOSmRNA expression level increased in penile tissue of DM model rats（P＜0.01），and its expression level was higher than the same time point of the NC group （P＜0.01）.Pearson correlation analysis showed there was a positive relationship of the expression level of AGEswith that of iNOS （r=0.845，P＜0.01）.Conclusion The expressions of AGEs and iNOS of penile tissue are markedly increased and closely correlated with each other in the status of high blood sugar and theymight collectively participate in the occurrence of penis injury in diabetes mellitus.

Diabetes mellitus；Penile tissue；Advanced glycation end products；Inducible nitric oxide synthase；Rat

R332

A

1674-4721（2015）02（c）-0008-05

2015-01-15本文編輯：許俊琴）