DNA分析技術在動物纖維鑒別領域的研究進展

董曉東++++楊素英++++丁楠++++俞艷彬

摘要：動物纖維的鑒別屬于紡織品檢測行業的難題之一，DNA分析技術因其客觀準確性而給動物纖維檢測客觀法帶來了曙光。本文主要綜述了DNA分析技術鑒別動物纖維的研究現狀，介紹了DNA分析技術的原理，并對其應用前景進行了展望。

關鍵詞：DNA技術；動物纖維；PCR擴增；PCR-RFLP技術；real-time PCR技術

1 引言

近幾年來，隨著人們生活水平的提高，天然動物纖維及皮革制品越來越受到消費者的青睞。目前，動物纖維檢測方法主要包括顯微鏡法 [1]和掃描電鏡法[2]，二者均通過纖維鱗片形態特征來對纖維種類進行鑒別。但是，動物纖維的形態特征會因加工條件、氣候條件及膳食結構等產生變化[3]，這就給顯微鏡法的鑒別帶來了困難，而且顯微鏡法對試驗人員的經驗要求較高，主觀干擾大，所以相關行業對客觀性高的檢測方法的需求越來越大。

近年來，隨著DNA分子技術的逐步成熟，研究人員通過鑒別不同動物的DNA序列信息，實現了動物纖維及其混合物的定性定量，并在逐步完善此技術。DNA分子技術由于其檢測結果的客觀性而廣泛應用于司法、醫學研究及診斷領域，同以上兩種方法相比，DNA法的檢測結果更加客觀準確。

2 DNA定性定量原理

DNA分子，即脫氧核糖核酸，是由堿基、脫氧核糖和磷酸組成的長鏈多聚物。不同的生物所具備的DNA分子在長短和結構上有一定的差異，堿基的排列順序也不盡相同[4]。通過對DNA分子的核苷酸排列順序進行測定即可實現對動物纖維的定性定量檢測。DNA分析檢測技術一般包括以下幾個步驟：

（1）DNA的提取。動物毛纖維的基因組DNA主要存在于毛囊部分，而紡織類動物纖維一般只取毛干部分，故只能提取毛干線粒體中的DNA。DNA的提取主要包括前處理、分離、純化和濃縮階段。此階段所提取的樣品將直接影響到后續的擴增及DNA序列的測定，高質量的DNA是實現DNA檢測的第一步，因此，提取的DNA樣品應防止其他因素的干擾與污染。

（2）PCR擴增。PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是生物體外特殊的DNA復制反應，能將微量的DNA大幅增加。目標DNA片段經過變性、退火、延伸三個基本反應步驟，在數小時內即可擴增放大數百萬倍。

（3）DNA序列的測定。DNA序列測定是檢測結果的關鍵所在。通過不同纖維所具備的特異堿基對排列即可實現對纖維的鑒別。目前，Sanger雙脫氧末端終止法在此領域應用較廣，通過電泳和放射自顯影技術對所提取的DNA片段進行測定，即可對纖維品種進行鑒別。

3 DNA檢測技術在動物纖維鑒別中的研究進展

隨著DNA分子技術的不斷發展，其在動物纖維鑒別領域的研究越來越廣。Hamlym P.F.等人在1992年首次制作了綿羊特性DNA探針，實現了對綿羊毛、山羊絨和馬海毛的鑒別[5]。由于當時DNA分子技術水平較低，極大地限制了DNA技術在動物纖維鑒別上的應用。

PCR擴增技術成功解決了動物纖維基因組中DNA量少、難以提取的問題。Subramanian等[6]提取纖維毛干中線粒體DNA，通過PCR擴增線粒體DNA細胞色素b基因的保守區域，然后選擇合適的酶切位點分析相應保守區的單核苷酸多態性，根據后片段長度的多態性成功鑒別出了山羊絨與綿羊毛。PCR-RFLP技術（限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術）是一種基于PCR擴增的技術，是目前識別山羊絨和綿羊毛的較好方法之一。但是，PCR-PFLP分析較為復雜，一般只能用來做定性分析，不做定量檢測。在此基礎上，Kirsten等[7]實現了對羊毛、羊絨、駱駝毛、牦牛毛等纖維快速簡便的纖維定性分析，并且比較了清洗、漂白和染色等3步處理工序對DNA抽提效果的影響，研究發現每增加一步處理工序都會明顯降低DNA的提取率，其中染色工序對DNA分析的破壞最為嚴重。

金美菊等[8]針對多種產地的羊絨和羊毛試驗，利用山羊與綿羊質檢特定堿基序列的差別，通過設計不同的引物成功實現對純羊絨、羊毛以及羊絨羊毛混合纖維定性鑒別。研究發現對于純羊絨、純羊毛纖維，采用1組引物（CYTBF/CYTBR）對特定位點特征堿基序列組實現對纖維的鑒別。對于羊絨羊毛混合物，采用羊絨引物（YM1_F/C7YGR1）和羊毛引物（YM1_F/W10YGR1）對混合纖維進行定性鑒別。通過對羊毛、羊絨引物的設計，有效地提高了檢測的靈敏度。

相比DNA直接測序法和PCR-RFLP法，Real-time PCR（實時熒光PCR技術）具有簡單、準確、快速的特點[9]。Real-time PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累計實時監測整個PCR過程，最終通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。費靜等[10]設計針對兔和狐線粒體12SrRNA基因的特異性TaqMan探針和引物對，建立了兔毛纖維和狐貍毛纖維的鑒別方法，此方法特異性較好，并且靈敏度達到了1%，并且在驗證實例中得到滿意的結果。紫山羊絨與牦牛毛在顯微鏡下外觀形態極其相似，非常難以鑒別，Lu等[11]設計針對牦牛毛和紫山羊絨12SrRNA基因的TaqMan探針和引物對，建立了牦牛毛纖維和紫山羊絨纖維的鑒別法，分別對染色和漂白樣品分別進行鑒別，鑒別結果也十分滿意，靈敏度也達到了1%。陳國培等[12]建立羊毛羊絨熒光PCR檢測體系，并對檢測方法特異性和檢出限進行分析，結果表明此方法特異性好，檢出限為10ngDNA，同時對16個樣品進行驗證檢測，結果與傳統鑒定方法具有一致性，靈敏度相較于傳統方法更優。

Real-time PCR不僅在動物纖維定性上表現優異，而且在定量領域也表現不俗。吉岡陽一郎[13]開發了一套基于Real-time PCR技術而用于動物毛纖維混合比率的鑒定方法，方法結果允差符合標準GB/T 29862規定。國內在此動物纖維定量領域也有一定的研究，Tang等[14]采用Real-time PCR技術，設計了兩套針對羊絨和羊毛的探針與引物對，驗證了線粒體12sRNA適合羊毛/羊絨混合物的定性試驗，同時也對不同比例的樣品及經染色整理的樣品的定量進行了研究，試驗結果與標稱值一致性很好。

隨著DNA檢測技術的不斷成熟，將可以對更多的動物纖維進行準確的定性和定量檢測分析。

4 難點及展望

DNA檢測技術是基于物種DNA序列的特異性，不依賴檢測人員主觀性，檢測結果更加客觀。但目前，DNA技術在動物纖維鑒別領域的應用依然存在一系列問題：

（1）高質量DNA的獲取。紡織品一般經過較多的前處理及后整理，比如堿處理、染色等，在一定程度上破壞了纖維的DNA結構。

（2）動物纖維自身的色素。天然動物纖維中所含的色素會抑制PCR擴增的進行。

（3）目前DNA定量研究多為二組分混紡產品，正處于起步階段。多組分混紡產品的DNA定量技術還有待進一步研究[15]。

DNA分析檢測技術具有非常廣闊的發展前景，目前已在多領域得到廣泛引用，我們應加大在這方面的研究和開發力度，以提高我國紡織領域的檢驗檢測水平。

參考文獻：

[1]GB/T 16988—2013 特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定[S].

[2]GB/T 14593—2008 山羊絨、綿羊毛及其混合纖維定量分析方法 掃描電鏡法[S].

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[15]張小莉， 池海濤， 張經華，等.羊絨和羊毛纖維檢測技術研究進展[J].毛紡科技， 2009，37（3）： 56-59.

（作者單位：國家羊絨產品質量監督檢驗中心，河北省纖維檢驗局）