高效液相色譜法測定陰地蕨中山奈酚和槲皮素含量*

何可群

(貴州民族大學化學與環境科學學院，貴陽 550025)

陰地蕨(Botrychium ternatum)是陰地蕨科陰地蕨屬多年生草本植物，又名肺心草、蕨葉一枝蒿、獨蕨箕、一朵云等［1-4］。陰地蕨以全草入藥，具有清熱解毒、止咳平喘、平肝息風的功效，主治風熱感冒、咽喉腫痛、百日嗽、肺結核、乳腺炎、腮腺炎、小兒驚風、瘡癰腫毒、目生翳障、火眼腫癢等，是我國西南地區白族、彝族、納西族、苗族等少數民族常用的野生草藥［1-5］。目前對陰地蕨的研究報道還很少，已有的資料表明，陰地蕨的化學成分主要為黃酮、三萜、皂苷、香豆素、揮發油等，其黃酮類成分為陰地蕨素，槲皮素3-O-α-L-鼠李糖-7-O-β-D-葡萄糖苷及木犀草素等［4-6］。通過文獻檢索，筆者還未見有關陰地蕨中山奈酚的研究報道。本實驗采用高效液相色譜-質譜串聯(HPLC-MS/MS)獲得分子量信息，進而通過與標樣保留時間對比，確定陰地蕨的山奈酚及槲皮素成分，以峰面積對濃度的回歸方程對兩種成分進行定量測定。研究結果可以為該民族藥的進一步開發及擴大資源利用提供科學依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1200 LC高效液相色譜儀(美國安捷倫儀器有限公司)及API3200 QTRAP MS/MS質譜儀(配ESI源、三重四級桿及線性離子阱，美國 AB SCIEX 公司)，Ecilipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱(上海笛柏實驗設備有限公司);Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，G1314F 1260 VWD 可變波長紫外檢測器，數顯恒溫水浴鍋(常州博遠實驗分析儀器有限公司)，METTLERAE240電子分析天平(上海天平儀器廠，感量:0.01 mg)。

1.2 試劑 山奈酚(批號:520-18-3)及槲皮素 (批號:117-39-5)對照品均購自貴州迪大科技有限責任公司。磷酸為優級純，甲酸、無水甲醇均為色譜純，濃鹽酸為分析純，所有試劑用超純水配制。陰地蕨樣品購自云南省云龍縣，經貴州民族大學盧文蕓教授鑒定為陰地蕨(Botrychium ternatum)，標本保存于貴州民族大學化學與環境科學學院藥學教研室。

2 方法與結果

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 HPLC-MS/MS 色譜柱為 Ecilipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱溫:35 ℃，流動相:甲醇-0.1%甲酸溶液(85∶15)，流速為 1.2 mL·min－1。電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，山奈酚采用MRM模式進行正離子監測，噴霧電壓為5.5 kV、離子源溫度600℃，去簇電壓62 V，掃描范圍m/z 50～305。槲皮素采用MRM模式進行負離子監測，噴霧電壓為－4.5 kV、離子源溫度 600 ℃，去簇電壓－55 V，掃描范圍m/z 50～305。

2.1.2 定量測定色譜條件 Agilent 1260 LC高效液相色譜儀，Eclipse plus C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5μm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(45∶55)，流速0.8 mL·min－1，檢測波長360 nm，柱溫30℃，進樣量10μL。

2.2 對照品儲備液的配制 精密稱取槲皮素、山奈酚對照品各20.00 mg，分別置于50 mL量瓶中，加無水甲醇適量使其溶解，以無水甲醇定容。搖勻，配制成質量濃度均為400μg·mL－1的單一對照品儲備液備用，臨用前稀釋為山奈酚0.800μg· mL－1及槲皮素1.00μg·mL－1濃度供質譜分析。

2.3 供試品溶液制備 將自然晾干的陰地蕨全草在電熱鼓風干燥箱中于(60±1)℃烘干3 h，精確稱取干燥、粉碎(過40目篩)的陰地蕨粉末0.250 g，用80%甲醇溶液20 mL浸泡、75℃水浴回流提取2次，每次1 h，提取結束后，合并提取液、冷卻、濾過。濾液用80%甲醇水溶液補足至40 mL，加鹽酸10 mL，85℃水浴回流酸水解1 h，迅速冷卻，用無水甲醇定容至50 mL，搖勻，臨用前過孔徑 0.45μm 濾膜［7-9］。

2.4 HPLC-MS/MS實驗 取對照品和供試品溶液3μL分別注入 HPLC-MS/MS，得到山奈酚對照品溶液、槲皮素對照品溶液、供試品溶液中的山奈酚及槲皮素的MS譜圖(圖1，2)。在正離子監測模式下，山奈酚對照品溶液和供試品溶液對應峰MS譜圖產生5個主要的特征碎片離子 m/z287，185，161，153，121(圖1)，m/s287為山奈酚的［M+H］+峰，證明樣品中含有山奈酚［10-11］;在負離子監測模式下，槲皮素對照品溶液和供試品溶液對應峰MS譜圖產生5個主要的特征碎片離子 m/s273，257，239，229，211(圖 2)，m/z301.0為槲皮素的［M+H］+峰，證明樣品中含有槲皮素［10-11］。由于采用負離子監測模式，槲皮素的MS圖譜中沒有出現m/z285峰。

2.5 保留時間的確定 將20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按“2.1.2”項色譜條件進樣分析，得到對照品及樣品色譜圖(圖3)。結果陰地蕨供試品出現與混合對照品中山奈酚(18.66 min)、槲皮素(10.11 min)保留時間一致的兩個峰。

2.6 線性關系考察 分別精密吸取質量濃度為400μg·mL－1的山奈酚、槲皮素標準溶液適量，配制成含山奈酚、槲皮素均為 2.50，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00μg·mL－1的混標溶液。以孔徑 0.45μm 濾膜濾過，分別進樣 10μL。在“2.1.2”項色譜條件測定峰面積，以對照品溶液濃度(X，μg·mL－1)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸分析，山奈酚:Y=29.85X－13.24，r=0.999 9;槲皮素:Y=43.86X－24.02，r=0.999 8。結果表明:山奈酚及槲皮素均在2.500～25.000μg·mL－1范圍內呈現良好的線性關系。

圖2 槲皮素對照品溶液(A)和陰地蕨供試品溶液(B)質譜圖Fig.2 ESI-MS spectrum of quercetin standard solution(A)and Botrychium ternatum solution(B)

2.7 精密度實驗 將質量濃度均為20.00μg·mL－1山奈酚、槲皮素混合對照品溶液按“2.1.2”項項色譜條件連續進樣5次進行分析，以峰面積計算山奈酚及槲皮素的RSD分別為0.98%，0.79%，表明方法精密度良好。

2.8 重復性實驗 取同一批樣品(批號:20140116)5份，按“2.3”項方法制備溶液，按“2.1.2”項色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算山奈酚及槲皮素的平均質量分數，其RSD分別為1.53%和1.82%，表明方法重復性良好。

2.9 穩定性實驗 分別在0，2，4，8 h將一供試品溶液按“2.1.2”項下色譜條件進行分析，測定色譜峰面積，計算山奈酚及槲皮素的RSD分別為2.36%，2.19%，表明供試品溶液在8 h內穩定性良好。

2.10 加樣回收率實驗 ①精密稱取5份已知含量的樣品(批號:20140116)各0.250 g，分別精密加入山奈酚標準溶液適量;②精密稱取5份已知含量的樣品(批號:20140116)各0.125 g，分別精密加入槲皮素標準溶液適量。分別按“2.3”項下方法制備溶液，按“2.1.2”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積，計算各成分的量及加樣回收率，結果山奈酚平均加樣回收率98.34%，RSD=1.89%;槲皮素平均加樣回收率98.68%，RSD=2.70%，見表 1。

1.槲皮素;2.山奈酚圖3 混合對照品(A)和陰地蕨(B)的高效液相色譜圖1.quercetin;2.kaempferolFig.3 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Botrychium ternatum(B)

表1 山奈酚和槲皮素加樣回收測定結果Tab.1 Results of recovery tests on on kaempferol and quercetin n=5

2.11 樣品測定 精密稱取3批陰地蕨樣品各3份，每份0.250 g，按“2.3”項下方法制備溶液，按“2.1.2”項色譜條件分別進行分析，測定峰面積，計算各成分的量，結果見表2。

表2 陰地蕨中山奈酚、槲皮素的測定結果Tab.2 Results of content determination on kaempferol and quercetin in Botrychium ternatum n=3

3 討論

研究證實，陰地蕨有顯著的抑制癌細胞增殖及轉移的作用［12］，但迄今為止，其資源還未得到有效的開發利用，對其化學成分的研究報道也很稀少。筆者在本實驗中用HPLC-MS/MS法對陰地蕨中山奈酚及槲皮素進行鑒定并測定二者的含量，首次報道陰地蕨中的山奈酚成分，實驗結果進一步證實陰地蕨抗菌、抗炎、止咳等功效的物質基礎，可以為該民族藥的藥用價值開發及擴大資源利用提供一定的科學依據。

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