藥用植物地黃不同部位粗提液體外抑菌活性的比較研究

李玉璽　劉俊華　馬海玲

摘 要：采用分光光度法分析比較了藥用植物地黃不同部位乙醇提取液的體外抑菌活性。以地黃花、葉、根等3個(gè)部位為試驗(yàn)材料，以80%乙醇為提取溶劑，制備乙醇提取液，以常見(jiàn)致病菌金黃色葡萄球菌為受試菌株，測(cè)定各處理菌懸液OD值，并計(jì)算抑菌率。研究結(jié)果表明，地黃不同部位醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用，不同部位抑菌效果不同，其中以地黃葉醇提液抑菌作用最強(qiáng)，當(dāng)濃度為80g/L時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率達(dá)到72.43%，MIC為5.0g/L，EC50值為10.651g/L，并且其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用與提取液質(zhì)量濃度間正相關(guān)性最為顯著。

關(guān)鍵詞：地黃；乙醇提取液；最低抑菌濃度；分光光度法

中圖分類(lèi)號(hào) S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）20-24-03

Abstract：To study the inhibition effects of Ethanol extracts from different part of the medicinal plant Rehmannia glutinosa on Staphylococcus aureus，ethanol-extracts from Rehmannia glutinosa were obtained with normal methods，and the liquid medium with different mass concentration of extracts from the flowers，leaves and roots of Rehmannia glutinosa were prepared，then oscillated the liquid medium of Staphylococcus aureus，which had been inoculated，and the bacteriostasis effects were tested by Spectrophotometric method. The results showed that Staphylococcus aureus was inhibited by the ethanol extracts of Rehmannia glutinosa，but different parts extracts had different inhibition effects，and the bacteriostasis activity was Leaf（72.43）>Flower（55.86%）>Root（55.42%） at the concentration of 80g/L. The MIC and EC50 of Leaf were 5.0g/L and 10.651g/L. The ethanol extracts of three parts of Rehmannia glutinosa all had inhibitory action on Staphylococcus aureus，and the ethanol extract of Rehmannia glutinosa leaves had stonger inhibitions activities than the extracts of other two parts，and the bacteriostatic effects was obviously along with the increase of concentration of ethanol extracts.

Key words：Rehmannia glutinosa；Ethanol extract；MIC；Spectrophotometric method

地黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科（Scrophulariaceae）地黃屬（Rehmannia）多年生直立草本植物[1]，其塊根是我國(guó)著名的傳統(tǒng)常用大宗中藥材[2-4]，已有研究多集中于地黃的產(chǎn)地適宜性、人工栽培、化學(xué)成分分析和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等方面[5-7]，而關(guān)于地黃提取液抑菌性方面的研究相對(duì)缺乏。

本文以藥用植物地黃的花、葉、根部為植物材料，以80%乙醇為提取溶劑，以金黃色葡萄球菌為受試菌株，測(cè)定了地黃植物體不同部位醇提液的抑菌活性，分析比較了地黃葉、花、根等不同部位乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度和抑菌中濃度，以期為開(kāi)發(fā)以地黃為植物源的生物抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 （1）儀器：LMQ.R立式滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、LH系列層流潔凈工作臺(tái)（濟(jì)南隆宏凈化設(shè)備有限公司）、250B生化培養(yǎng)箱（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）、FA1004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、756PC紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)。（2）材料：本研究所用地黃材料采自濱州學(xué)院校園內(nèi)；供試菌株為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus saccharolyticus），由濱州學(xué)院生命科學(xué)系微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基本培養(yǎng)基的配制 按陳金春等[8]的方法，配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH值為7.2。

1.2.2 菌種活化及菌液的制備 菌種活化參考趙錦慧等[9]的活化方法。無(wú)菌條件下挑取少許活化后的金黃色葡萄球菌放入無(wú)菌生理鹽水中，搖勻后制備得菌懸液，調(diào)節(jié)其菌體密度為102cfu/mL。

1.2.3 地黃乙醇提取液的制備 將采集得到的地黃除雜洗凈，自然陰干，后用剪刀分別將根、葉、花剪碎研磨成粉。分別準(zhǔn)確稱取各部位干粉8.0g，置于帶塞廣口瓶?jī)?nèi)，加50mL80%的乙醇，室溫條件下靜置浸提24h，然后用濾紙過(guò)濾除去殘?jiān)占癁V液，并定容至100mL，即得質(zhì)量濃度為80g/L的地黃各部位乙醇浸提液，于4℃冷藏避光保存，備用。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 取冷藏備用的地黃各部位提取液母液（80g/L），依次對(duì)半稀釋得到質(zhì)量濃度為40g/L、20g/L、10g/L、5g/L、2.5g/L的醇提液，分別加入0.1mL菌懸液，同時(shí)設(shè)生長(zhǎng)對(duì)照（菌懸液+80%乙醇+培養(yǎng)基）和清水對(duì)照（菌懸液+清水+培養(yǎng)基），培養(yǎng)12h后觀察菌株生長(zhǎng)情況，無(wú)菌生長(zhǎng)的最低處理濃度即為乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC。

1.2.5 提取液抑菌作用測(cè)定 采用分光光度計(jì)法測(cè)定地黃根、葉、花等3個(gè)部位醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用。將分別裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管若干，置于超凈工作臺(tái)中紫外滅菌30min。于無(wú)菌條件下，準(zhǔn)確量取3mL地黃各部位乙醇提取液和200μL金黃色葡萄球菌菌懸液分別加入上述試管中。另取1支裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管，加入3mL相應(yīng)地黃提取液、200μL LB液體培養(yǎng)基，不接任何菌株作為空白對(duì)照；同時(shí)，取1支裝有5mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基試管，加入200μL金黃色葡萄球菌菌懸液和3mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基，作為含菌對(duì)照。每一處理均為3次重復(fù)，置于搖床（37±0.5）℃下恒溫培養(yǎng)24h后，使用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定600nm處菌懸液OD值，依據(jù)下式計(jì)算抑菌率：

抑菌率（%）=（1-處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Windows XP操作系統(tǒng)下應(yīng)用Excel 2003進(jìn)行匯總與整理，運(yùn)用Spss19.0進(jìn)行LSD多重比較和Duncan檢驗(yàn)以及Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 本研究共設(shè)從0g/L～80g/L7個(gè)乙醇提取液濃度梯度，以測(cè)定地黃3個(gè)部位乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。由表1可以看出，地黃不同部位乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度存在較大差異，其中以地黃葉乙醇提取液的抑菌效果最強(qiáng)，其MIC值為5.0g/L，即在5.0g/L質(zhì)量濃度下即具有較強(qiáng)的抑菌效果；而地黃根和地黃花的醇提液MIC分別為10.0g/L、20.0g/L。

2.2 不同部位抑菌作用的比較分析

2.2.1 地黃不同部位醇提液的抑菌作用比較 圖1為地黃不同部位醇提液處理樣品600nm處的OD值。由圖1可知，在低質(zhì)量濃度下（2.5～20g/L），地黃根部、花部醇提液吸光值間無(wú)顯著差異，而二者均明顯高于地黃葉醇提液處理組吸光值；在中高濃度（40～80g/L）時(shí)，地黃葉醇提液OD值隨著質(zhì)量濃度增加的降幅明顯，說(shuō)明在較高質(zhì)量濃度下，其抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的能力顯著增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度為80g/L時(shí)，3個(gè)部位的抑菌作用為地黃葉>地黃花>地黃根。

2.2.2 地黃不同部位醇提液抑菌活性的濃度效應(yīng) 對(duì)地黃提取液質(zhì)量濃度和抑菌率間進(jìn)行相關(guān)性分析，得不同部位乙醇提取液抑菌力回歸方程（圖2～圖4）。由圖2～4可知，隨著地黃各部位醇提液質(zhì)量濃度的增加，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用均呈明顯遞增趨勢(shì)，且表現(xiàn)為對(duì)數(shù)式增長(zhǎng)。

抑菌活性與提取液質(zhì)量濃度間的相關(guān)性分析表明，地黃葉部醇提液抑菌力的濃度效應(yīng)最為顯著（R2=0.994，P=0.015），其次為花部（R2=0.983，P=0.024），而根部表現(xiàn)出的抑菌作用的濃度效應(yīng)最不明顯（R2=0.887，P>0.05）。

2.2.3 地黃不同部位醇提液抑菌中濃度（EC50） 依據(jù)圖2～圖4所得抑菌活性與提取液質(zhì)量濃度的回歸方程，計(jì)算得到地黃葉、花、根等部位醇提液對(duì)金黃色葡萄球菌的EC50值，分別為10.651g/L、41.814g/L、31.480g/L，表明地黃葉乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用要顯著優(yōu)于花部和根部。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)北方地區(qū)的地黃，其花期一般為4～5月份，最佳采收期為9～10月份，中藥地黃為地黃的塊根，是我國(guó)傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)國(guó)藥[10-12]。本試驗(yàn)初步研究了地黃不同部位乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用、最低抑菌濃度以及EC50值，結(jié)果表明，地黃不同部位乙醇提取液對(duì)金黃色葡萄球菌均具有抑制作用，其葉片醇提液的抑菌效果要強(qiáng)于根部和花部。同時(shí)，從質(zhì)量濃度與抑菌力相關(guān)性水平和回歸方程來(lái)看，都表明地黃葉醇提液具有更強(qiáng)的抑菌效果，其最低抑菌濃度（MIC）和抑菌中濃度（EC50）等指標(biāo)水平也明顯低于根部和花部提取液。

本研究中，地黃葉醇提液表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌作用，可能與研究所用地黃材料有關(guān)，可能是植物采集時(shí)地黃葉中積累了相對(duì)較多的次生代謝活性物質(zhì)；已有研究表明，地黃葉具有比根部更豐富的梓醇資源，具有很高的開(kāi)發(fā)價(jià)值[11]。本研究?jī)H就地黃的根、葉和花等部位乙醇提取液抑菌活性進(jìn)行了分析和比較，今后將開(kāi)展不同極性溶劑提取物和抑菌機(jī)理方面的研究，以期為地黃資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)與技術(shù)參考。

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（責(zé)編：張宏民）