連續長波紫外線照射對人皮膚成纖維細胞胞吞、降解彈性蛋白的影響

劉晨 賴維 許慶芳 侯巍 鄭躍 吳琳 王宇鍵

連續長波紫外線照射對人皮膚成纖維細胞胞吞、降解彈性蛋白的影響

劉晨 賴維 許慶芳 侯巍 鄭躍 吳琳 王宇鍵

目的 研究連續長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞胞吞和胞內降解細胞外彈性蛋白能力的影響，探討光老化皮膚彈性蛋白堆積的機制。方法 將人皮膚成纖維細胞分為空白對照組和連續UVA照射組，連續UVA照射組予連續7 d每天9.9 J/cm2UVA照射以構建人皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型。用流式細胞儀和衰老相關β半乳糖苷酶染色法分別檢測細胞周期和細胞老化程度以驗證模型。用熒光示蹤技術和共軛淬滅技術，比較兩組細胞對培養基中彈性蛋白的胞吞情況和對胞吞進入細胞的彈性蛋白的降解情況差異。結果 與空白對照組相比，連續UVA照射組G1期細胞比例和衰老細胞比例明顯增高，人皮膚成纖維細胞慢性光損傷模型構建成功。空白對照組人皮膚成纖維細胞在與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后對彈性蛋白的胞吞率依次為（10.0±1.4）%、（27.8±4.2）%、（39.9±4.1）%，連續UVA照射組人皮膚成纖維細胞在對應時間點的胞吞率依次為（9.9±1.6）%、（28.3±5.1）%、（42.0±5.7）%，在相同時間點兩組細胞對彈性蛋白的胞吞率差異均無統計學意義（均P>0.05）。空白對照組人皮膚成纖維細胞在與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后，胞內降解內吞入胞的彈性蛋白的細胞百分率依次為（7.7±0.9）%、（22.8±1.8）%、（33.9±3.1）%，而連續UVA照射組人皮膚成纖維細胞在對應時間點依次為（4.2±1.1）%、（16.5±2.4）%、（26.7±2.6）%，均較對照組顯著降低（均P<0.05）。結論 連續7 d每日9.9 J/cm2UVA照射對人皮膚成纖維細胞胞吞彈性蛋白的能力沒有明顯影響，卻使細胞對胞吞的彈性蛋白的胞內降解能力下降。

成纖維細胞；皮膚衰老；紫外線；彈性蛋白；蛋白水解；胞吞作用

作者單位：510630廣州，中山大學附屬第三醫院皮膚性病科（劉晨、賴維、許慶芳、鄭躍、吳琳、王宇鍵）；新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科（侯巍）

光線性彈性組織變性是皮膚光老化特征性病理改變之一［1］，主要表現為真皮彈性組織變性堆積，研究發現堆積物質主要由彈性蛋白構成。大量研究表明紫外線照射可以使基質金屬蛋白酶（MMP）和中性粒細胞彈性蛋白酶等分泌增加［2-3］，這些蛋白酶具有對細胞外基質成分的降解作用［4］，然而增多的MMP和中性粒細胞彈性蛋白酶卻沒有逆轉光老化真皮彈性組織堆積這一現象。彈性蛋白的降解過程目前尚未完全明確，比較公認的觀點是基質中聚合的彈性蛋白被基質中的酶解離為彈性蛋白單體、多肽、小分子等成分［5］，最后被細胞重新攝取利用。光老化真皮彈性蛋白堆積不僅涉及基質中降解彈性組織的酶，與真皮中細胞對彈性蛋白單體、多肽、小分子等成分的重新攝取、降解利用也密切相關。目前發現的可以胞吞彈性蛋白單體并將其降解再利用的真皮細胞有巨噬細胞和皮膚成纖維細胞［6-7］，這為研究光老化真皮彈性蛋白堆積機制提供了新的方向。本研究旨在通過體外細胞實驗探索在連續長波紫外線（UVA）照射下，人皮膚成纖維細胞對胞外彈性蛋白胞吞能力和細胞內降解能力的變化。

材料與方法

一、實驗材料

1．細胞：人皮膚成纖維細胞來源于中山大學附屬第三醫院泌尿外科3～6歲健康兒童包皮環切術后包皮組織，已告知兒童監護人組織用途并簽署知情同意書。本研究經過中山大學附屬第三醫院臨床研究倫理委員會批準。

2.試劑和儀器：0.25%胰酶、DMEM高糖培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青鏈霉素、Bodipy-quence標記的牛頸部韌帶來源可溶性彈性蛋白、Alex-fluor488蛋白熒光標記試劑盒產自美國Life Technologies公司，細胞衰老β半乳糖苷酶（SA-β-Gal） 產自美國 Cell signaling technology 公司，二甲基亞砜、Ⅰ型膠原酶、牛頸部韌帶來源可溶性彈性蛋白產自美國Sigma公司，BCA蛋白定量試劑盒、細胞周期檢測試劑盒產自南京凱基生物科技發展有限公司。UVA照射儀和UVA輻照度探測儀產自上海希格瑪高技術有限公司，UVA照射儀燈管為Philips UVA TL10RS，波長320～400 nm。酶聯免疫檢測儀（美國BioTek公司），CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），普通光學顯微鏡（日本Nikon Instruments公司），倒置熒光顯微鏡（德國Leica Microsystems公司），流式細胞儀（美國BD Biosciences公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

二、方法

1.細胞的分離、培養與傳代：將3～6歲健康兒童的包皮組織于75%乙醇浸泡3 min，用含有青鏈霉素的PBS漂洗，常規表真皮分離，將剪碎的組織于含Ⅰ型膠原酶的DHANKS溶液中37℃孵育7 h，離心去膠原酶后加入完全培養基（含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的 DMEM 高糖培養基）接種到培養皿中，37℃、5%CO2條件下孵育培養。原代細胞經傳代培養到第3代凍存。細胞復蘇后6代以內細胞進行后續實驗。

2.分組和UVA照射：實驗分為連續UVA照射組和空白對照組。兩組細胞均按5×105個/皿接種于6 cm細胞培養皿，待細胞長到70%融合時，將兩組細胞棄培養基，PBS洗滌2次去掉殘余培養基，每皿加等量薄層PBS。連續UVA照射組置于UVA輻照儀下，細胞距離光源15 cm，平均照射功率為12.7 mW/cm2，設置單次照射時間為780 s，照射劑量為 9.9 J/cm2［8-10］，每日同一時間照射 1 次，連續照射7 d；空白對照組給以與照光時長等同的避光處理。照射完成后UVA照射組和對照組均棄PBS溶液，加入完全培養液，置于95%濕度、含5%CO2的37℃培養箱繼續培養。

3.β半乳糖苷酶染色檢測老化比率：末次UVA照射后48 h去除細胞培養基，PBS洗滌1次，按照試劑盒說明書依次加入固定液室溫固定15 min，PBS洗滌2次，加入β半乳糖苷酶染色工作液，于37℃干燥的無CO2的培養箱孵育過夜。光學顯微鏡下觀察結果。老化細胞胞質被染成藍色，每皿至少計數500個細胞，計算陽性細胞所占百分比。

4.流式細胞儀檢測細胞周期：末次UVA照射后，用胰酶消化細胞，離心收集細胞，預冷PBS洗滌細胞2次，70%預冷乙醇4℃固定12 h。再次離心收集細胞，PBS洗滌，500 μl PBS重懸細胞，加入存儲濃度為 10 g/L的 RNA 酶 5 μl，37℃水浴 30 min，再加入5 g/L碘化丙錠存儲液5 μl使其工作濃度為50 mg/L，4℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測并記錄激發波長488 nm處紅色熒光。

5.細胞對培養基中彈性蛋白的胞吞情況并計算胞吞率：末次UVA照射后，兩組細胞加入含有25 mg/L Alex-fluor488熒光標記的可溶性彈性蛋白的完全培養基，在37℃細胞培養箱分別培養24、48、72 h后棄培養基，0.4%錐蟲藍淬滅細胞外熒光，PBS洗滌，4%甲醛固定細胞，1 mg/L Hoechst33342室溫孵育3 min進行細胞核染色，PBS洗滌。熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察24、48、72 h兩組細胞對彈性蛋白的胞吞情況并拍照，每組每次觀察至少1 000個細胞以計算胞吞率（發出綠色熒光的細胞/細胞總數×100%）。因為Alex-fluor488染料非常穩定即使被胞吞的蛋白已在胞內降解成多肽甚或小分子，也同樣能夠發出熒光起到示蹤作用。

6.細胞對內吞進入細胞的彈性蛋白的降解情況：末次UVA照射后兩組細胞加入含有25 mg/L Bodipy-quence標記可溶性彈性蛋白（DQ-elastin）的完全培養基。在37℃分別培養24、48、72 h后棄培養基，0.4%錐蟲藍淬滅細胞外熒光，PBS洗滌，4%甲醛固定細胞，1 mg/L Hoechst33342室溫孵育3 min進行細胞核染色，PBS洗滌。熒光顯微鏡下和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察24、48、72 h兩組細胞對培養基中彈性蛋白的細胞內降解情況并拍照，每組每次觀察至少1 000個細胞以計算胞內降解了已胞吞的彈性蛋白的細胞占所有觀察細胞的百分率（發出綠色熒光的細胞/細胞總數×100%）。DQ彈性蛋白是使用Bodipy熒光染料過度標記彈性蛋白，這種標記方法使染料之間因為距離過近產生共軛淬滅現象以致在激發光下無熒光發出，當被標記的蛋白被降解后，染料之間距離分開共軛淬滅現象消失，染料在對應波長的激發光下產生熒光，提示蛋白被降解。

結 果

一、UVA照射對人皮膚成纖維細胞細胞周期的影響

與空白對照組相比，連續7 d每日9.9 J/cm2UVA照射使人皮膚成纖維細胞G1期細胞比例從（50.75±0.20）%增高到 （59.9 ± 0.18）%（n=3，t=59.91，P<0.01），S期細胞比例從（39.79±0.21）%減少到（29.66 ± 1.31）%（n=3，t=13.18，P<0.01），G2期細胞比例尚未發生明顯變化（n=3，t=1.473，P>0.05）。見圖 1。

圖1 連續7 d每日9.9 J/cm2長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞細胞周期的影響 1A：空白對照組；1B：連續UVA照射組

二、UVA照射對人皮膚成纖維細胞β半乳糖苷酶染色陽性率的影響

空白對照組細胞β半乳糖苷酶染色陽性率（胞質成藍色細胞所占百分率）為（3.07±0.74）%，而連續7 d每日9.9 J/cm2UVA照射后該陽性率增高到（22.93±1.47）%，兩組差異有統計學意義（n=3，t=12.09，P<0.05）。見圖 2。

圖2 連續7 d每日9.9 J/cm2長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞β半乳糖苷酶染色陽性率的影響（倒置顯微鏡×200），胞質呈藍色的代表染色陽性細胞，即衰老細胞 2A：空白對照組；2B：連續UVA照射組

三、UVA照射對人皮膚成纖維細胞胞吞彈性蛋白能力的影響

隨著與胞外彈性蛋白共孵育時間的延長，UVA照射組和空白對照組兩組細胞對彈性蛋白的胞吞率（胞吞了彈性蛋白的細胞/所有觀察細胞×100%）逐漸增高，在與彈性蛋白共孵育24、48、72 h時，兩組細胞對胞外彈性蛋白的胞吞率差異無統計學意義（均P>0．05），見表 1，圖 3。

四、UVA照射對HDF降解已胞吞的彈性蛋白能力的影響

隨著與彈性蛋白作用時間的延長，兩組細胞逐漸降解已胞吞的彈性蛋白，胞內降解了內吞入胞（即已胞吞）的彈性蛋白的細胞比例逐漸增高，但UVA照射組在相同時間點降解內吞入胞的彈性蛋白的細胞百分率均較對照組降低，差異有統計學意義（均P<0.05），見表 1，圖 4。

討 論

近年來，光老化真皮彈性纖維的變化逐漸受到重視，但其具體機制尚不完全清楚。在真皮彈性纖維變性方面，一些學者發現長期紫外線照射可以通過引起氧化應激［11-12］和蛋白異常沉積等途徑使彈性纖維結構改變和成分變性。在真皮彈性纖維堆積方面，現有的研究結果尚不能明確解釋其形成機制。堆積的彈性纖維的主要成分是彈性蛋白，彈性蛋白異常堆積的機制可能涉及如下幾個方面：①彈性蛋白變性后影響酶對其降解，使彈性蛋白降解減少；②彈性蛋白變性后影響細胞對其成分的胞吞作用，使細胞對其攝取利用減少；③光損傷的細胞對彈

性蛋白的胞吞能力下降，彈性蛋白成分不能及時被細胞攝取利用；④光損傷的細胞對已胞吞的彈性蛋白的降解利用能力下降。近期研究證實，紫外線引起的彈性蛋白變性可以不同程度地抵制中性粒細胞彈性蛋白酶和MMP等酶的降解［13］，但這僅從彈性蛋白的細胞外降解環節解釋了彈性蛋白堆積的原因。

表1 連續7 d每日9.9 J/cm2長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞胞吞和降解彈性蛋白能力的影響（±s）

表1 連續7 d每日9.9 J/cm2長波紫外線（UVA）照射對人皮膚成纖維細胞胞吞和降解彈性蛋白能力的影響（±s）

注：n=3。表中24 h、48 h、72 h分別代表與培養基中彈性蛋白共孵育的時間

組別 胞吞率（%） 降解已胞吞彈性蛋白細胞（%）24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h空白對照組 10.0±1.4 27.8±4.2 39.9±4.1 7.7±0.9 22.8±1.8 33.9±3.1連續UVA照射組 9.9±1.6 28.3±5.1 42.0±5.7 4.2±1.1 16.5±2.4 26.7±2.6 t值 0.03 0.15 0.64 4.27 3.61 4.13 P值 >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 <0.05 <0.05

圖3 連續7 d，每日9.9 J/cm2UVA照射對人皮膚成纖維細胞（HDF）胞吞彈性蛋白能力的影響（3A～3F：倒置熒光顯微鏡×200；3G～3H：激光掃描共聚焦顯微鏡×400） 藍色為細胞核，箭頭表示發出綠色熒光的物質，即被HDF胞吞的彈性蛋白，胞外的彈性蛋白的熒光已被臺盼藍淬滅。3A、3C、3E：分別是空白對照組細胞與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后，對培養基中彈性蛋白的胞吞率逐漸增加；3B、3D、3F：分別是連續UVA照射組細胞與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后，對培養基中彈性蛋白的胞吞率逐漸增加。3G和3H分別是空白對照組和連續UVA照射組細胞與彈性蛋白共孵育48 h后胞吞彈性蛋白的放大圖

圖4 連續7 d，每日9.9 J/cm2UVA照射對人皮膚成纖維細胞胞內降解已胞吞的彈性蛋白能力的影響（4A～4F：倒置熒光顯微鏡×200；4G～4H：激光掃描共聚焦顯微鏡×400） 藍色為細胞核，綠色表示胞吞進入細胞的彈性蛋白被降解，如彈性蛋白被胞吞但未被降解則不發出熒光；在細胞外被細胞分泌的酶所降解的彈性蛋白發出的熒光已被臺盼藍淬滅；箭頭指示發出綠色熒光的物質，即被降解的彈性蛋白。4A、4C、4E：分別是空白對照組細胞與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后，降解了內吞入胞的彈性蛋白的細胞比例逐漸上升；4B、4D、4F分別是連續UVA照射組細胞與彈性蛋白共孵育24、48、72 h后，降解了內吞入胞的彈性蛋白的細胞比例逐漸上升；4G和4H：分別是空白對照組和連續UVA照射組細胞與彈性蛋白共孵育48 h后胞內降解培養基中彈性蛋白的放大圖

本研究發現，連續7 d每日9.9 J/cm2UVA照射后，人皮膚成纖維細胞對彈性蛋白的胞吞能力沒有明顯改變，而對已胞吞的彈性蛋白的降解能力卻明顯降低。這個結果說明，在紫外線照射還沒有引起人皮膚成纖維細胞對彈性蛋白胞吞能力變化時，就已經引起了細胞對已胞吞的彈性蛋白降解能力的下降。由此我們推測，紫外線照射引起的細胞光損傷使其對已胞吞的彈性蛋白降解能力減弱是光老化真皮彈性蛋白堆積的形成機制之一。細胞對已胞吞的蛋白降解能力的下降與細胞溶酶體內酶的表達和功能有關，研究表明，溶酶體組織蛋白酶K在人皮膚成纖維細胞降解彈性蛋白中起重要作用［6，14］，我們前期實驗發現在慢性光損傷的人皮膚成纖維細胞中組織蛋白酶K的表達明顯下降［15-16］，這可能是慢性光損傷的人皮膚成纖維細胞對彈性蛋白降解減少的一個重要原因。

由于我們實驗所采用的照射方式對人皮膚成纖維細胞的損傷較輕，主要表現在細胞增殖減慢，而照射后老化細胞比率從3%只增高到23%，屬于細胞慢性光損傷的早期表現，所以我們的結果尚不能完全闡明在光老化皮膚中成纖維細胞對彈性蛋白胞吞能力的變化，只能說明在光老化的早期階段人皮膚成纖維細胞對彈性蛋白的胞吞能力可能沒有明顯改變，彈性蛋白異常堆積與細胞對已胞吞的彈性蛋白的降解能力下降有關。

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Effects of repetitive ultraviolet A radiation on the endocytosis and degradation of elastin by human skin fibroblasts

Liu Chen*,Lai Wei,Xu Qingfang,Hou Wei,Zheng Yue,Wu Lin,Wang Yujian.*Department of Dermatology and Venereology,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510630,China

ObjectiveTo investigate the effects of repetitive ultraviolet A（UVA）radiation on the endocytosis and intracellular degradation of extracellular elastin by human dermal fibroblasts（HDFs）,and to explore the mechanism responsible for elastin accumulation in photoaging skin.MethodsCultured HDFs were divided into two groups:repetitive UVA radiation group treated with UVA radiation（9.9 J/cm2）once a day for seven consecutive days to establish a chronic photodamage model,and blank control group receiving no treatment.For the verification of the model,flow cytometry was performed to detect cell cycle,and senescence-associated β-galactosidase staining to determine the degree of cell senescence.Fluorescent tracer technique and conjugated polymer-based fluorescence quenching technique were conducted to observe the endocytosis and intracellular degradation of extracellular elastin in culture media by HDFs in these groups.ResultsCompared with the blank control group,the repetitive UVA radiation group showed increased proportions of G1-phase cells and senescent cells,which confirmed the successful establishment of chronic photodamage model in the repetitive UVA radiation group.After coculture with elastin for 24,48 and 72 hours,the endocytosis rate of elastin was 10.0%±1.4%,27.8%±4.2%and 39.9%±4.1%respectively in the blank control group,9.9%±1.6%,28.3%±5.1%and 42.0%±5.7%respectively in the repetitive UVA radiation group,with no significant difference between the two groups at the three time points （allP>0.05）.The percentage of cells showing intracellular degradation of extracellular elastin was significantly lower in the repetitive UVA radiation group than in the blank control group（4.2%±1.1%vs.7.7%±0.9%at 24 hours,16.5%±2.4%vs.22.8%±1.8%at 48 hours,26.7%±2.6%vs.33.9%±3.1%at 72 hours,allP<0.05）.Conclusions UVA radiation at 9.9 J/cm2for 7 consecutive days can decrease the intracellular degradation of extracellular elastin by HDFs,but has no obvious effect on endocytosis of elastin.

Fibroblasts;Skin aging;Ultraviolet rays;Elastin;Proteolysis;Endocytosis

Lai Wei,Email:drlaiwei@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.010

國家自然科學基金面上項目（81171523）

賴維，Email：drlaiwei@163.com

2014-08-21）

（本文編輯：尚淑賢）