體外鑒定衣原體質粒侵襲細胞相關毒力基因

畢田田 王娜 侯淑萍 劉原君 岑醒洪 王惠平

體外鑒定衣原體質粒侵襲細胞相關毒力基因

畢田田 王娜 侯淑萍 劉原君 岑醒洪 王惠平

目的 比較幾種轉化沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）對宿主細胞的感染力，鑒定與衣原體質粒侵襲細胞相關的毒力基因。方法 培養攜帶敲除了不同開放閱讀框架（ORF）質粒的轉化菌株，并不斷擴增收集。測定濃度后，以相同菌量接種并按離心+二乙胺乙基葡聚糖（DEAE）、離心、DEAE、無任何處理4個條件分別對菌株進行處理，采用間接免疫熒光法計數包涵體數目；分別于（20、40、60 h）觀察各菌株連續3代感染細胞后菌斑形成速度與面積。用Lugol碘染色觀察各菌株包涵體內糖原合成情況。結果 敲除質粒編碼蛋白Pgp4的菌株 pGFP::CMΔPgp4在 4種條件下包涵體數目分別為（10.20±1.30）、（6.80±0.44）、（3.00±1.22）、（0.80±0.45）個，陰性對照組質粒缺失株CMUT3包涵體數目分別為（6.40±0.89）、（3.80± 0.83）、（1.60±0.89）、（0.60± 0.54）個，同一條件下兩者均表現出相近的感染力，包涵體數目均低于同一條件下其他菌株（均P<0.01）。同一菌株不同條件下，包涵體數目差異有統計學意義（F=845.310，P<0.01），各菌株在離心+DEAE條件下包涵體數目最多；連續3代感染細胞時菌斑形成速度和大小均低于其他菌株；并有糖原累積的障礙。結論 Pgp4是衣原體質粒侵襲細胞相關的毒力基因之一。

沙眼衣原體；質粒；包涵體；毒力；基因；體外研究

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,Ct）感染在全球呈增長態勢，已居性傳播疾病首位［1］。Ct感染與輸卵管阻塞關系密切，是造成不孕不育的主要原因之一［2-3］。Ct對輸卵管的致病機制尚不明確，許多實驗室對衣原體質粒缺失株和野生株進行了對比性研究，發現質粒缺失株在體內實驗中對于動物組織引起的病變均明顯低于野生株，甚至不引起病變［4-6］。研究發現，決定輸卵管病變的毒力基因位于衣原體質粒上［7］，但迄今尚未鑒定出具體的毒力基因。Ct質粒長約7.5 kb，共編碼8個開放閱讀框架（ORF）pORF1-8［8］，導致輸卵管病變的基因或許在這8個ORF中，毒力基因可能是一個或多個ORF，在感染的過程中表達8種蛋白，分別為質粒編碼蛋白 Pgp1-8。在轉錄水平上發現，Pgp1、2、6、8 對于維持質粒的穩定性是必須的，無法進行基因敲除。目前已成功敲除Pgp3、4、5、7，并構建了重組質粒的轉化菌株［9］，在此基礎上，本實驗旨在體外實驗中初步鑒定毒力基因并探索其致病的機制，為臨床治療Ct感染提供新的思路。

作者單位：300052天津醫科大學總醫院皮膚科（畢田田、侯淑萍、劉原君、岑醒洪、王惠平）；蘭陵縣婦幼保健院檢驗科（王娜）

資料與方法

一、資料

1.細胞及菌株來源：Hela細胞系由天津市性傳播疾病研究所細胞培養室保存。鼠肺炎型沙眼衣原體菌株：WT為野生株，CMUT3為質粒缺失株，pGFP::CM為鼠型沙眼衣原體Mopn菌株質粒CM與pGFP載體融合菌株。pGFP上攜帶氨芐西林的抗性基因，可用含氨芐西林的培養基對融合成功的質粒進行篩選，pGFP載體還可以表達發綠色熒光的蛋白。pGFP::CMΔPgp3、4、5、7分別為敲除開放閱讀框不同基因的質粒攜帶株。各菌株原體EB來自美國得克薩斯大學圣安東尼奧醫學科學中心鐘光明教授實驗室，保存于-80℃中備用。

2.主要試劑：細胞培養液（含Earlys鹽的MEM培養基，10%胎牛血清，50 mg/L慶大霉素）；衣原體感染液（細胞培養液中加入兩性霉素B、萬古霉素和1 mg/L放線菌酮）；二乙胺乙基葡聚糖（DEAE-D）；細胞消化液：0.25%胰酶液與0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）的混合液，兩者體積比 1∶3，0.2 μm 抽濾器抽濾滅菌；SPG磷酸鹽緩沖液：蔗糖74.62 g，磷酸二氫鉀0.512 g，磷酸氫二鉀1.237 g，L谷氨酸0.845 g，溶于800 ml水中，用10 mol/L NaOH調節至7.2，用純水調節最終體積至1L，0.2 μm濾器抽濾滅菌，分裝后4℃保存；一抗為單克隆抗體MC22（鼠抗沙眼衣原體主要外膜蛋白MOMP蛋白），來自美國得克薩斯大學圣安東尼奧醫學科學中心鐘光明教授實驗室；二抗為FITC標記山羊抗小鼠IgG，來自北京中杉金橋生物技術有限公司。

3.主要器材：6孔細胞培養板、24孔細胞培養板、細胞刮子購自美國Costar公司，超凈工作臺購自天津市醫療器械工業公司醫藥凈化設備廠。

二、方法

1.細胞培養：將Hela細胞從液氮罐中復蘇培養成功后，接種到6孔培養板，在5%CO2溫箱37℃培養16～24 h，待細胞長成致密單層后吸出培養液，每孔加入30 mg/L DEAE-D 2 ml室溫下作用30 min。

2.沙眼衣原體的培養與擴增：吸出各細胞孔中的DEAE-D液，加離心液（不加血清的DMEM液），將凍存于-80℃的上述菌株常溫解凍，倍比稀釋后接種于預先放置有載玻片的24孔板上，32℃1 200×g離心1 h，5%CO2孵箱37℃培養20～24 h。采用間接免疫熒光技術檢測包涵體以確定衣原體培養成功，并觀察不同稀釋度下各菌株的感染率。在6孔板中進行衣原體的擴增，擴增時選用感染率達60%左右的稀釋濃度進行接種，擴增數代后，選用1 000 ml SPG收集2個6孔板的衣原體，每管50 μl分裝至無菌的微量離心管中，-80℃保存，待測衣原體濃度。

3.間接免疫熒光法對沙眼衣原體濃度的測定：將不同菌株按 1 ∶1 000、1 ∶2 000、1 ∶4 000……倍比稀釋后接種于預先放置有載玻片的24孔板中，培養20～24 h后，吸出細胞培養孔中的衣原體感染液，用預冷的PBS洗滌；冰甲醇固定單層細胞10 min；經預冷PBS洗滌1遍；用200～500 μl含10%胎牛血清的DMEM液封閉放于4℃8 h；加入一抗（1∶40稀釋）200 μl，4℃過夜；PBS清洗 6遍；加入二抗（1∶80稀釋）50 μl避光放于37℃孵箱中1 h；PBS洗滌3～6遍；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡（×400）觀察計數，計算不同菌株的濃度。每ml包涵體形成單位（IFU）=鏡下包涵體個數×876.16×稀釋倍數×（1 000/實際體積）。

4.在4種條件下計數包涵體：不同菌株均以1.5×104IFU接種，每個菌株接種時均設置4個不同的條件（離心+DEAE、離心、DEAE、無任何處理），培養20～24 h后，間接免疫熒光法計數不同條件每孔包涵體的數目。計數時每孔計數5個不同的視野最后計算平均值。

5.菌斑形成情況：將不同菌株按能達相近的感染率（約10%）時的菌量接種，衣原體感染宿主細胞后，分別在20、40、60 h固定細胞，免疫熒光染色，觀察不同菌株連續3代感染細胞后的菌斑形成情況。

圖1 接種培養后通過間 接免疫熒光檢測包涵體（箭頭，免疫熒光× 400） 1A ～ 1G：分別表示野生株WT、質粒缺失株CMUT3、融合菌株pGFP::CM、轉化菌株pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp4 、pGFP : : CMΔPgp5 、pGFP::CMΔPgp7；培養后均見包涵體形成

6.沙眼衣原體包涵體Lugol碘液染色檢查：吸出細胞培養孔中的衣原體感染液，自然風干或者吹干后，用冰甲醇固定單層細胞10 min，Lugol碘液母液用蒸餾水稀釋4～5倍后染色，觀察不同菌株的包涵體內糖原染色情況。

三、統計學分析

各組實驗重復3次，用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。所有數據用±s表示，同一條件下菌株pGFP::CMΔPgp4與其他菌株包涵體數目的比較和不同條件下同一菌株間包涵體數目之間的比較，采用析因設計的方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、接種培養后通過間接免疫熒光檢測包涵體

免疫熒光顯微鏡下觀察（×400），可見亮綠色、具有直徑2～3 mm典型大小中強綠色的點狀或團塊狀熒光即為包涵體，見圖1。

表1 各衣原體菌株濃度測定結果

二、各衣原體菌株濃度測定的結果

不同稀釋濃度的菌株接種培養20～24 h后，按條件（離心+DEAE）進行處理，采用間接免疫熒光法，×400免疫熒光顯微鏡下觀察并計數每孔包涵體數目，每個稀釋濃度計數5個視野，按公式計算所收集的微量離心管管中衣原體濃度。見表1。

三、體外檢測各菌株感染能力

按相同的菌量（1.5×104IFU）接種，比較各轉化菌株在不同條件侵襲和粘附宿主細胞的能力。陽性對照組為野生株WT，陰性對照組為質粒缺失株CMUT3。見圖2。

圖2 不同條件下不同菌株包涵體數目 1：WT；2：CMUT3；3：pGFP::CM；4：pGFP::CMΔPgp3；5：pGFP::CMΔPgp4；6：pGFP::CMΔPgp5；7：pGFP::CMΔPgp7

析因分析提示不同條件之間各菌株包涵體數目差異有統計學意義（F=845.310，P<0.01），離心+DEAE條件下包涵體數目最多，無任何處理時包涵體數目最少，提示離心和DEAE均能增強毒力基因在體外對宿主細胞的侵襲和粘附能力；相同條件下pGFP::CMΔPgp4與 WT，pGFP::CM，pGFP::CMΔPgp3，pGFP::CMΔPgp5，pGFP::CMΔPgp7兩兩比較，包涵體數目均較低，差異有統計學意義，（F值分別為558.036，801.825，234.146，1324.473，121.784，均P<0.01），提示Pgp4是衣原體質粒侵襲細胞相關的毒力基因之一；不同條件和不同菌株之間交互效應顯著（F=89.645，P<0.01）。

四、各菌株菌斑形成能力的檢測

菌斑形成實驗是用來檢測衣原體在細胞與細胞之間的傳播能力的方法之一。本實驗中，各菌株連續3代感染細胞后，在相同時間段（感染后20、40、60 h）觀察各菌株菌斑形成的速度及大小，結果發現，在相同感染率接種的情況下，相同時間段野生株菌斑形成速度最快，面積最大；質粒缺失株菌斑形成速度慢，面積?。籔gp4敲除的菌株菌斑形成速度與面積均低于其他菌株，提示Pgp4基因影響衣原體在細胞與細胞之間的傳播能力。

五、各菌株糖原合成能力的檢測

倒置顯微鏡下觀察包涵體內糖原染色，野生株和毒力基因攜帶株中糖原染色陽性，包涵體呈紅褐色或棕褐色。質粒缺失株CMUT3和質粒敲除株pGFP::CMΔPgp4糖原染色陰性，提示Pgp4基因影響糖原的積累。見圖3。

討 論

衣原體質粒是一個相對分子質量小，基因序列高度保守的雙鏈環狀DNA分子。廣泛存在于多種衣原體中，其中包括沙眼衣原體及鼠肺炎衣原體。通過質粒缺失株和野生株的對比性研究，發現質粒是參與衣原體致病的毒力因子［10］。質粒缺失株的成功轉化，為研究質粒攜帶株的致病性提供了分子學基礎，為鑒定出具體的毒力基因，闡明致病機制提供可能。

沙眼衣原體的自然宿主是人，雖然它能成功感染小鼠的下生殖道，但卻不能引起小鼠輸卵管的病變，沙眼衣原體鼠肺炎株（MoPn）也稱為鼠肺炎衣原體，現已劃分為一個新的衣原體種（Chlamydia muridarum）［11］，經證實不僅可以感染小鼠的生殖道，而且還可引起輸卵管的病變［12］，與女性泌尿生殖道Ct感染后的疾病發展過程一致［13］。目前，MoPn鼠生殖道感染模型已被廣泛應用于Ct致病機制及疫苗研發等方面的研究［11］。目前運用基因重組技術已成功構建了重組質粒pGFP::CM，并成功轉化了質粒缺失株CMUT3。Pgp1，2，6，8是維持質?；窘Y構的因子，故目前只成功敲除了Pgp3、4、5、7并構建各轉化菌株［14］。轉化成功的菌株命名為 pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp4、pGFP::CMΔPgp5、pGFP::CMΔPgp7［15］。

在體外試驗中，相同菌量接種培養時，質粒缺失株CMUT3和Pgp4敲除的菌株免疫熒光顯微鏡下計數包涵體數目均明顯低于其他菌株，提示質粒缺失株CMUT3和Pgp4敲除的菌株對宿主細胞的感染能力低于其他菌株。碘染時兩菌株均出現包涵體內糖原染色障礙，提示Pgp4是與毒力基因密切相關的轉錄調節因子并影響包涵體內糖原的合成；以相同感染率接種培養相同時間觀察各菌株菌斑形成情況發現，Pgp4敲除的菌株與質粒缺失株菌斑形成速度與面積均低于其他菌株，提示毒力基因Pgp4影響衣原體在細胞與細胞之間傳播的能力，可為動物實驗鑒定影響衣原體上行感染能力的毒力基因提供基礎。Pgp4是質粒編碼的開放閱讀框中最小的片段，編碼102個氨基酸［15］，質粒編碼的許多基因的表達都依賴于Pgp4［14］，無論是在沙眼衣原體或者鼠型沙眼衣原體感染中，均已證實Pgp4是一個正轉錄調節因子［15］。

圖3 碘染色在倒置顯微鏡下觀察衣原體包涵體（箭頭，碘染色 × 100） 3A、3C、3D、3F、3G：分別表示野生株、融合菌株pGFP::CM、轉化菌株pGFP::CMΔPgp3、pGFP::CMΔPgp5、pGFP::CMΔPgp7，均可見棕褐色包涵體形成；3B、3E：分別表示質粒缺失株和pGFP::CMΔPgp4菌株細胞內均未見包涵體形成

本研究還對衣原體的培養設定了4種條件：離心+DEAE、離心、DEAE-D、無任何處理。4種條件下，Pgp4敲除的菌株間接免疫熒光結果顯示包涵體形成數目均最少，離心+DEAE-D的條件下，各菌株包涵體形成數目均最多，提示DEAE和離心都能增加衣原體毒力基因對宿主細胞的侵襲和粘附能力。離心作用的原理是通過離心力使衣原體粒子容易沉淀在細胞表面而提高感染率，DEAE-D的強化作用可能是其帶正電荷因而同帶負電的沙眼衣原體結合起到一種吸附作用。本研究在國內首次采用基因敲除的重組質粒菌株來感染細胞，在體外試驗中初步鑒定出侵襲細胞的毒力基因Pgp4，為進一步進行動物實驗提供一定基礎。

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Identification of cell invasion-related virulence genes in chlamydial plasmidsin vitro

Bi Tiantian*,Wang Na,Hou Shuping,Liu Yuanjun,Cen Xinghong,Wang Huiping.*Department of Dermatology,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China

ObjectiveTo compare the infectivity of several transformedChlamydia trachomatis（Ct）mouse pneumonitis（Mopn）strains to host cells,and to identify cell invasion-related virulence genes in Chlamydial plasmids.MethodsSeveral Ct strains,including wild-type Ct Mopn strain（WT strain）,plasmid-free Ct strain（CMUT3 strain）,Ct Mopn strain transformed with the shuttle vector carrying pGFP and the completeC.muridarum（CM）plasmid（pGFP::CM strain）and Ct Mopn strains transformed with shuttle vectors carrying pGFP and mutant CM plasmids with inframe deletions of Pgp3,4,5 or 7 （pGFP::CM△Pgp3,4,5,7 strains）,were cultured,amplified and collected.After the concentrations of Ct were determined,each of these strains was divided into four groups to be inoculated at a same amount（1.5 × 104inclusion forming units（IFU））followed by four different treatments respectively:centrifugalization+DEAE group treated with centrifugalization followed by ion-exchange chromatography on diethylaminoethyl（DEAE）-cellulose columns,centrifugalization group treated with centrifugalization only,DEAE group treated with chromatography on DEAE-cellulose columns only,control group receiving no treatment.After additional culture for 20-24 hours,indirect immunofluorescence assay was performed to count the number of chlamydial inclusions.At 20,40 and 60 hours after infection,the growth rate and area of chlamydial plaques were assessed after three continuous passages.Lugol′s iodine staining was conducted to observe glycogen synthesis in bacterial inclusions.ResultsThe inclusion number in the centrifugalization+DEAE group,centrifugalization group,DEAE group and control group was 10.20±1.30,6.80±0.44,3.00±1.22 and 0.80±0.45 respectively for the pGFP::CM△Pgp4 strain,6.40±0.89,3.80±0.83,1.60±0.89 and 0.60±0.54 respectively for the CMUT3 strain.Under same experiment conditions,the pGFP::CM△Pgp4 strain and CMUT3 strain showed similar infectivity,and formed less inclusions compared with the other Ct strains （allP<0.01）.The number of inclusions formed by the same Ct strains were significantly different among the 4 groups（F=845.310,P<0.01）,and were highest in the centrifugalization+DEAE group for all the strains.The pGFP::CM△Pgp4 strain showed significantly lower growth rate and area of plaques with an abnormality in glycogen accumulation compared with the other strains at 20,40 and 60 hours after infection.ConclusionThe plasmid-encoding gene Pgp4 may be a cell invasionassociated virulence gene in chlamydial plasmids.

Chlamydia trachomatis;Plasmids;Inclusion bodies;Virulence；Genes；In vitro

Wang Huiping,Email:huiping1208@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.003

國家自然科學基金青年科學基金（81301469）

王惠平，Email：huiping1208@163.com

2014-05-23）

（本文編輯：吳曉初）