高IgE綜合征患者STAT3基因突變研究

李仲桃 汪盛 王曦

高IgE綜合征患者STAT3基因突變研究

李仲桃 汪盛 王曦

目的 探討1例以全身多發冷膿腫為主要表現的高IgE綜合征患者STAT3基因突變。方法收集患者及其父母的臨床資料及外周血，提取基因組DNA，PCR擴增STAT3基因外顯子與剪切位點序列，通過DNA測序查找基因突變。結果 發現患者STAT3基因第16號外顯子存在一個錯義突變1427C→T，導致密碼子由TCC變為TTC，致使位于STAT3蛋白DNA連接區第476位氨基酸從絲氨酸（S）變為苯丙氨酸（F）（p. S476F）。患者父母均未發現此突變。酶切分析的結果與上述發現一致。結論 STAT3基因S476F突變為新型錯義突變，該例高IgE綜合征患者以全身廣泛冷膿腫為突出表現。

Job綜合征；膿腫；STAT3轉錄因子；突變

高IgE綜合征（hyper-IgE syndrome，HIES）又稱Job綜合征，是一種罕見而復雜的原發性免疫缺陷病。臨床上主要以頑固性濕疹樣皮炎、反復皮膚和肺部感染、血清IgE及血嗜酸性粒細胞水平顯著增高為特征［1］。常染色體顯性遺傳HIES多由于信號傳導和轉錄激活酶3（STAT3）基因突變引起，臨床表現為多系統異常［2］。我們對1例以全身反復多發冷膿腫為主要表現的HIES患者的STAT3基因進行突變分析，發現了1個新突變。

一、病歷資料

患者男，17歲。因反復全身結節、膿腫16年，紅斑、丘疹11年于2014年5月26日入院。16年前，左小腿屈側出現約6 cm結節并逐漸形成膿腫，無壓痛，無皮溫增高，在當地醫院切開引流出大量膿液。此后全身頻繁出現類似結節、膿腫。11年前，軀干、四肢反復出現針尖至米粒大紅斑、丘疹伴瘙癢，搔抓后出現大量滲液。4年前出現反復咳嗽、咳痰伴發熱。就診前1個月，患者右側鼻翼、頭皮及右側腹股溝先后出現大小不等的結節。患者平素體弱，否認過敏史、外傷史及手術史。家系中無遺傳病史，父母非近親結婚。體檢：體溫36.7℃，慢性病容，神志清楚，鼻翼增寬，眼深陷，前額突出。頭頸部及右側腹股溝可捫及多個黃豆至蠶豆大小腫大淋巴結，無觸痛，可推動。心界不大，雙肺呼吸音粗，脊柱輕微左側彎。皮膚科檢查：全身可見較多紅斑（圖1）、丘疹及綠豆大色素減退斑，頭皮可見6個大小不等膚色結節，部分結節可捫及波動感。眉間及右側面部可見1個巴掌大紅色包塊，質韌，無觸壓痛，邊界清，無破潰（圖2）。右側腹股溝可見1個雞蛋大小膚色包塊，質軟，無壓痛（圖3），穿刺抽出約10 ml黃綠色膿液。實驗室及輔助檢查：白細胞17.34×109/L，中性粒細胞13.21× 109/L，嗜酸性粒細胞2.48×109/L；IgE＞3 000 IU/ml。脊柱X線片：胸腰段脊柱輕度側彎。頭部CT：左側額葉腦軟化灶；頜面部及頭皮軟組織增厚，腫塊形成。頭部增強MRI：左側額葉異常信號影；右側頜面部、鼻部、額部及右頂部軟組織內多發病變。胸部CT：雙肺多發空洞及結節灶；左上肺多發肺大泡，部分支氣管輕度擴張。全腹增強CT：肝實質內低密度影；右側腎旁后間隙、髂肌淺面、腹股溝前外下方囊狀影，腰背部皮下脂肪內囊狀影。頭頂及右腹股溝膿腫處抽取膿液培養均見金黃色葡萄球菌生長。根據1999年美國國立衛生研究院HIES診斷評分系統［3］。該患者NIH評分為71分，診斷為高IgE綜合征。

圖1 患者腹部紅斑、丘疹

圖2 患者頭皮及面部多個包塊

圖3 患者右側腹股溝包塊

二、STAT3基因突變檢測

1.外周血基因組DNA提取：本研究經醫院倫理委員會批準，患者及其父母簽署知情同意書。采集該患者及其父母外周血各4 ml，2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃冷凍保存。用試劑盒提取基因組DNA，方法參照說明書。取適量DNA原液用紫外分光光度計進行定量和純度檢測，其余放-20℃保存備用。

2.引物設計與合成：通過美國國家生物信息中心的基因庫檢索到STAT3基因序列，用Premier Primer 5軟件設計STAT3各外顯子引物，擴增包括編碼序列和剪切位點序列。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

3.PCR擴增：PCR擴增體系25 μl，含10×緩沖液2.5 μl、0.8 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2、0.5 μmol/L引物、模板DNA 0.2 μg、Taq DNA聚合酶1 U。PCR反應條件：94℃預變性5 min后，94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸1 min，共35個循環。72℃后延伸5 min。PCR產物4℃保存，取5 μl PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

4.PCR產物測序分析：PCR產物純化后，用ABI PRISM 3730XL自動測序儀直接雙向測序。用Sequencer 4.10.1 Demo軟件與基因組序列進行比對分析，查找有無突變。

5．酶切分析：對患者及其父母以及100例非相關的健康個體血液標本進行靶向突變檢測，用限制性核酸內切酶BsaHI切割PCR產物，酶切體系20 μl，含PCR產物10 μl、10×酶切緩沖液2.0 μl、1.5 g/L BSA、限制酶5 U，37℃過夜，65℃10 min滅活。酶切片段用2%溴乙錠瓊脂糖電泳分離，在GelDoc 1000 system（美國Bio-Rad公司）上觀察結果。

三、結果

患者STAT3基因第16號外顯子存在一個錯義突變1427C→T，導致密碼子由TCC變為TTC，致使位于STAT3蛋白SH2結構域的第476位氨基酸從絲氨酸變為苯丙氨酸（p.S476F）（圖4A），患者父母均未發現此突變（圖4B）。患者父母及100例健康對照的酶切分析結果也未發現該突變（圖5），患者突變型片段未發生酶切（468 bp），患者父母及100例健康對照個體的血液標本酶切產物長度為154 bp與314 bp。

圖4 STAT3基因測序結果 4A：患者DNA測序顯示錯義突變1427C→T，導致密碼子由TCC變為TTC，使得第476位氨基酸從絲氨酸（S）變為苯丙氨酸（F）；4B：患者父親的STAT3基因序列圖

圖5 患者突變型片段未發生酶切（468 bp），患者父母及100例健康對照個體的標本酶切產物長度為154 bp與314 bp M：標準參照物；1：患者；2：患者父親；3：患者母親；4、5：健康對照；6：未酶切片段

四、討論

本例患者具有AD-HIES的典型臨床表現，包括多系統的異常，如頑固性濕疹、全身多發性化膿性感染、特殊面容、脊柱側凸等。引起AD-HIES患者感染最常見的病原體是金黃色葡萄球菌、嗜血菌屬、肺炎鏈球菌和念珠菌［4］。臨床上以金黃色葡萄球菌性肺炎和金黃色葡萄球菌感染引起的皮膚膿腫多見。典型的皮膚膿腫為局部不紅、不痛，皮溫不高的冷膿腫［5］，通常不伴發熱等全身癥狀。本例患者以冷膿腫為突出的臨床表現，膿腫不僅反復發生于皮膚，而且在腦、肺、肝甚至腎旁后間隙及髂肌淺面也有發現。查閱文獻，出現如此廣泛冷膿腫的HIES罕見報道。

AD-HIES由STAT3基因突變引起。本例患者通過基因檢測，發現STAT3基因存在S476F突變。查閱STAT3基因突變數據庫和相關文獻，未見此突變報道，該突變也未列入SNP數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/），在100例健康對照個體中也未發現該突變，因而其系單核苷酸多態性的可能性很小。患者父母均未發現此突變，說明其為新發生的生殖細胞突變，患者系散發的常染色體顯性遺傳HIES。

［1］李強.高IgE綜合征［J］.實用兒科臨床雜志,2012,27（21）:1631-1634.

［2］薛麗,張敏,楊元,等.高IgE綜合征患者STAT3基因突變的研究［J］.中華皮膚科雜志,2013,46（10）:716-718.

［3］Grimbacher B,Sch?ffer AA,Holland SM,et al.Genetic linkage of hyper-IgE syndrome to chromosome 4［J］.Am J Hum Genet,1999, 65（3）:735-744.

［4］Freeman AF,Holland SM.The hyper-IgE syndromes［J］.Immunol Allergy Clin North Am,2008,28（2）:277-291.

［5］Holland SM,DeLeo FR,Elloumi HZ,et al.STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome［J］.N Engl J Med,2007,357（16）:1608-1619.

Mutation analysis of the STAT3 gene in a patient with hyper-IgE syndrome

Li Zhongtao,Wang Sheng,Wang Xi. Department of Dermatovenereology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China
Corresponding author:Wang Sheng,Email:wangsheng1892@sina.com

ObjectiveTo analyze mutations of the STAT3 gene in a patient with hyper-IgE syndrome（HIES）mainly manifesting as multiple cold abscesses.MethodsClinical data were collected and blood samples were obtained from a 17-year-old male patient with HIES and his parents.Genomic DNA was extracted and subjected to PCR for the amplification of the entire coding region and splice sites of the STAT3 gene followed by bidirectional sequencing.ResultsA heterozygous missense mutation C1427T，which caused a codon change from TCC to TTC and resulted in the substitution of serine by phenylalanine at amino acid residue 476（p.S476F）,was found in exon 16 encoding the DNA-binding domain in the STAT3 gene in the patient,but not in either of his parents.The results of amplified ribosomal DNA restriction analysis were consistent with the findings mentioned above.Conclusion A novel missense mutation S426F was found in the STAT3 gene in the HIES patient with generalized cold abscesses as the prominent clinical manifestation.

Job′s syndrome;Abscess;STAT3 transcription factor;Mutation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.019

610041成都，四川大學華西醫院皮膚性病科

汪盛，Email：wangsheng1892@sina.com

2015-01-09）

（本文編輯：顏艷）