活化抗原CD69、HLA-DR在尋常性銀屑病外周血單一核細(xì)胞和皮損中的表達(dá)

陳文娟 顧俊瑛 龔瑜 劉至昱 許輝 熊惠姊 史玉玲

活化抗原CD69、HLA-DR在尋常性銀屑病外周血單一核細(xì)胞和皮損中的表達(dá)

陳文娟 顧俊瑛 龔瑜 劉至昱 許輝 熊惠姊 史玉玲

目的 探討活化抗原CD69和HLA-DR在尋常性銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞和皮損中的表達(dá)變化。方法 流式細(xì)胞儀檢測20例尋常性銀屑病患者和20例健康對照外周血CD3+T細(xì)胞中CD69和HLA-DR的表達(dá)，同時采用免疫組化的方法檢測15例尋常性銀屑病患者和10例健康對照皮損組織中HLADR的表達(dá)并進(jìn)行對比。兩組統(tǒng)計學(xué)分析采用雙側(cè)t檢驗。結(jié)果 CD69和HLA-DR在尋常性銀屑病患者外周血CD3+T細(xì)胞中的表達(dá)率分別為（4.70±1.90）%、（8.97±1.79）%，比健康對照組［（1.56±0.95）%、（3.02± 1.15）%］明顯升高（均P＜0.01）。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CD3+HLA-DR+細(xì)胞百分比與銀屑病皮損和嚴(yán)重程度評分指數(shù)（PASI）評分呈正相關(guān)（r＝0.5626，P＜0.05）。與健康對照組比較，尋常性銀屑病患者皮損真皮中HLADR表達(dá)升高，但表皮中HLA-DR表達(dá)降低（均P＜0.05），HLA-DR在健康人主要分布在血管周圍，而在尋常性銀屑病患者則廣泛表達(dá)于真皮組織。結(jié)論 尋常性銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞及皮損中的炎癥細(xì)胞存在異常活化，外周血CD3+HLA-DR+細(xì)胞與疾病嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。

銀屑病；抗原，CD69；HLA-DR抗原；T淋巴細(xì)胞；淋巴細(xì)胞活化；疾病嚴(yán)重程度指數(shù)

銀屑病是一種以T淋巴細(xì)胞異常活化和浸潤為主要特征的慢性炎癥性皮膚病，其病因尚不清楚，涉及遺傳、免疫調(diào)節(jié)、環(huán)境及精神等多種因素［1］。其中，免疫失調(diào)和體內(nèi)免疫狀態(tài)的改變是銀屑病反復(fù)發(fā)作和加重的關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病發(fā)病早期即有T淋巴細(xì)胞浸潤皮損，銀屑病患者外周血淋巴細(xì)胞亞群也發(fā)生了變化［2］。為了解皮損和外周血單一核細(xì)胞（PBMC）中免疫細(xì)胞的活化情況，我們采用流式細(xì)胞儀和免疫組化方法對尋常性銀屑病患者PBMC和皮損組織中活化抗原CD69和HLADR的表達(dá)及分布情況進(jìn)行檢測，并分析其意義。

對象與方法

一、對象

1.血液標(biāo)本：20例尋常性銀屑病患者外周血標(biāo)本取自同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科門診，所有病例均符合尋常性銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分≥10以及皮損面積＞10%體表面積的尋常性銀屑病的患者；所有患者入組前1個月內(nèi)未接受過系統(tǒng)治療，2周內(nèi)未外用銀屑病治療藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：有嚴(yán)重感染和免疫抑制的患者；合并有肝、腎或其他嚴(yán)重疾病的患者；妊娠及哺乳期婦女。健康對照組20例，均為健康成人獻(xiàn)血員。本研究通過同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者和健康對照者均簽署知情同意書。共入組尋常性銀屑病患者20例，其中男12例，女8例，平均年齡51（28～82）歲，發(fā)病持續(xù)時間（6.2±6.5）年，PASI評分為17.8±7.4，其中3例患者有家族史。

2.組織標(biāo)本：選取其中15例尋常性銀屑病患者進(jìn)行皮損組織病理檢查，10例健康對照組的皮膚來自于整形外科手術(shù)腰背部正常皮膚，對皮膚組織病理切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測。

二、主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液來自美國 MPbio公司；RPMI1640、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清來自奧地利PAA Laboratories GmbH公司；佛波酯（PMA）和離子霉素來自美國Sigma-Aldrich公司。抗人CD 69異硫氰酸熒光素（FITC）、抗人CD3 APC-cy3（別藻藍(lán)蛋白-3H吲哚菁型染料）、固定破膜液試劑盒（fixation&permeabilization kit）來自美國eBioscience公司；anti-HLA-DR抗體來自美國Abcam公司；羊抗兔 IgG來自美國 The Jackson Laboratory公司；Biosciences FACScantoII流式細(xì)胞儀來自美國BD公司；PV9000二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

三、方法

1.流式細(xì)胞儀檢測CD3+CD69+和CD3+HLADR+細(xì)胞表達(dá)：采集所有受試者外周靜脈血5 ml，用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法獲得外周血單一核細(xì)胞（PBMC）。用含2%胎牛血清的染色緩沖液將PBMC重懸、計數(shù)，將PBMC細(xì)胞濃度調(diào)整到1× 106個/ml，分別加入3個流式管中。試管1為同型對照；在試管2中加入anti-HLA-DR一抗孵育30 min，1 ml PBS洗滌2次，然后加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗和抗人CD3 APC-cy3室溫孵育30 min；試管3中加入抗人CD3 APC-cy3和CD69 FITC室溫孵育30 min。1 ml PBS洗滌2次，加入300 μl染色緩沖液立即上機檢測。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果采用flowjo6.5進(jìn)行分析，圈定淋巴細(xì)胞門后，設(shè)定CD3+的T淋巴細(xì)胞門，分別分析CD3+CD69+和CD3+HLA-DR+淋巴細(xì)胞比率。

2.免疫組化檢測HLA-DR在皮損的表達(dá)：采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，經(jīng)5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水化，微波法抗原修復(fù)，3%過氧化氫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，依次滴加正常山羊血清工作液（封閉）、一抗工作液、生物素化二抗工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。采用PBS代替一抗為空白對照，以人淋巴組織做為陽性對照。陽性結(jié)果判定及Garcia半定量方法：細(xì)胞膜、胞質(zhì)不著色或陽性細(xì)胞＜5%為陰性（-），細(xì)胞膜、胞質(zhì)或細(xì)胞間隙呈黃色或陽性細(xì)胞在5%～25%之間為陽性（+），呈深黃色或陽性細(xì)胞在26%～75%之間為強陽性（++），呈棕黃色或陽性細(xì)胞＞75%為極強陽性（+++）。半定量法結(jié)果判定：在×400光鏡下，隨機選擇10個視野，分別計數(shù)每視野表皮和真皮100個有核細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行處理。計量資料以±s表示，兩組間用t檢驗雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、尋常性銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞中HLA-DR和CD69的表達(dá)

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，早期活化抗原CD69在尋常性銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)率明顯高于其在健康對照組中的表達(dá)率［（4.70± 1.90）%，（1.56±0.95）%，t＝6.629，P＜0.01］，見圖1。CD69在CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的陽性百分比分別為（3.45±0.46）%、（3.50±0.55）%，明顯高于健康對照組［（1.71±0.17）%、（2.11±0.41）%］，其中CD4+CD69+細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝3.571，P＜0.01），而CD8+CD69+的T細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝2.015，P＞0.05）。晚期活化抗原HLA-DR在尋常性銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)水平較健康對照組也顯著增高［（8.97±1.79）%比（3.02±1.15）%，t＝6.204，P＜0.01］，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測銀屑病患者和健康對照外周血CD3+細(xì)胞中CD69（1A）和HLA-DR（1B）的表達(dá) FITC為異硫氰酸熒光素，APC-cy3為別藻藍(lán)蛋白-3H吲哚菁型染料

二、銀屑病CD3+CD69+T淋巴細(xì)胞和CD3+HLADR+T淋巴細(xì)胞與PASI評分相關(guān)性分析

尋常性銀屑病患者CD3+CD69+T淋巴細(xì)胞百分比與患者PASI評分不相關(guān)（r＝0.33，P＞0.05），而CD3+HLA-DR+T淋巴細(xì)胞百分比與患者PASI評分呈正相關(guān)（r＝0.56，P＜0.05）。

三、HLA-DR在尋常性銀屑病和健康對照皮膚組織中的表達(dá)比較

尋常性銀屑病組和健康對照組的皮膚中均有HLA-DR表達(dá)，但是HLA-DR在尋常性銀屑病皮損組織中主要在真皮層大量炎癥細(xì)胞浸潤的部位有廣泛表達(dá)，表皮層則僅有較少的表達(dá)。HLA-DR在健康對照皮膚組織中主要分布在真皮血管分布的區(qū)域，表皮中也有散在表達(dá)（圖2）。HLA-DR半定量結(jié)果見表1，尋常性銀屑病組皮損表皮層HLA-DR陽性細(xì)胞百分比為（11.80±5.55）%，比健康對照組（27.40±8.61）%明顯降低，t＝5.479，P＜0.01。尋常性銀屑病組真皮層HLA-DR的陽性細(xì)胞表達(dá)百分比為（64.87±17.31）%，較健康對照組（19.80± 5.69）%顯著升高，t＝7.916，P＜0.01。

圖2 銀屑病患者皮損和健康對照組織HLA-DR免疫組化結(jié)果 銀屑病患者（2A）表皮全層HLA-DR表達(dá)細(xì)胞較少，在基底層有少量表達(dá)，真皮淺層HLA-DR表達(dá)強陽性，細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)染成深棕色（×400）。健康對照（2B）表皮HLA-DR有明顯散在的陽性表達(dá)，真皮全層僅血管組織周圍有強陽性（×400）。陰性對照組（2C）無深棕色的陽性表達(dá)（×200）

討論

銀屑病是一種在一定遺傳背景下，效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫紊亂性炎癥性皮膚病［3-4］，活化的T細(xì)胞在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［5-6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞活化后表達(dá)多種表面分子，其中研究較多的活化抗原有CD69、CD25及HLA-DR等，這些分子的表達(dá)可作為T淋巴細(xì)胞活化的指標(biāo)，已被廣泛用于研究T淋巴細(xì)胞的功能［6］。

研究顯示，3種激活相關(guān)抗原CD69、HLA-DR和CD25在T細(xì)胞受體激活后在特定時間表達(dá)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。CD69是淋巴細(xì)胞活化最早表達(dá)的膜表面分子，在絲裂原或抗原刺激下可迅速而短暫地表達(dá)于各種活化的淋巴細(xì)胞表面［7］，它可作為共刺激信號促進(jìn)T細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖。研究顯示，甲氨蝶呤治療銀屑病可下調(diào)CD69的表達(dá)［8］。本研究結(jié)果顯示，CD69在尋常性銀屑病患者外周血CD3+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的表達(dá)相比健康對照顯著升高，而在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)無明顯變化。Ferenczi等［6］對銀屑病患者外周血和皮損的激活相關(guān)抗原和共刺激分子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CD69在銀屑病皮損表皮表達(dá)明顯升高而真皮僅輕度升高，同時HLA-DR和CD25在銀屑病患者外周血T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)也明顯升高。研究顯示，銀屑病皮損中T淋巴細(xì)胞的浸潤與疾病的反復(fù)發(fā)作及加重有關(guān)，提示T細(xì)胞的活化狀態(tài)或許可以評估銀屑病的疾病進(jìn)展和臨床治療效果。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，中重度斑塊狀銀屑病患者外周血CD3+細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞百分比與患者的PASI評分呈正相關(guān)，而CD69+細(xì)胞百分比與患者PASI評分無明顯相關(guān)性，可以推測，在中重度銀屑病患者中，晚期活化抗原HLA-DR的表達(dá)百分比與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。

表1 尋常性銀屑病患者和健康對照皮膚組織中HLA-DR免疫組化半定量結(jié)果（例）

本研究發(fā)現(xiàn)，尋常性銀屑病患者外周血T細(xì)胞有較高水平的CD69表達(dá)，而在健康對照組中表達(dá)很低，提示在尋常性銀屑病患者外周血中有較多處于激活狀態(tài)的T細(xì)胞。Ferenczi等［6］發(fā)現(xiàn)銀屑病患者局部皮損T淋巴細(xì)胞中CD69的表達(dá)幾乎達(dá)到80%，而健康對照T細(xì)胞的CD69表達(dá)則很低。本研究中銀屑病患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD69的百分比僅為（4.7±1.90）%，提示病變局部的T淋巴細(xì)胞處于更高水平的免疫活化狀態(tài)。此外，對HLA-DR表達(dá)的研究顯示在尋常性銀屑病患者外周血T細(xì)胞中HLA-DR的表達(dá)明顯高于健康對照，但是健康對照也有一定程度的HLA-DR表達(dá)，可能是正常存在的APC的表達(dá)。在銀屑病局部皮損組織中，HLA-DR的表達(dá)主要分布在真皮組織中，而不是健康對照的表皮和血管周圍，這種組織分布的差異也提示銀屑病患者T細(xì)胞的免疫活化狀態(tài)差異。HLA-DR抗原表達(dá)在APC（如朗格漢斯細(xì)胞、樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞等）上發(fā)揮抗原提呈作用［9］，在激活的T細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞也有一定的表達(dá)［9-10］。免疫組化染色顯示，HLA-DR在健康對照者主要表達(dá)在表皮以及真皮血管周圍，這與表皮中存在朗格漢斯細(xì)胞有關(guān)；在銀屑病皮膚組織中HLA-DR主要表達(dá)在真皮層的炎癥細(xì)胞浸潤的部位，而在表皮組織中的表達(dá)很少，可能是由于這些部位有大量的T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤。

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Expressions of activation antigens CD69 and HLA-DR in peripheral blood mononuclear cells and skin lesions of patients with psoriasis vulgaris

Chen Wenjuan,Gu Junying,Gong Yu,Liu Zhiyu,Xu Hui,Xiong Huizi,Shi Yuling. Department of Dermatology,Shanghai Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Shi Yuling,Email:shiyuling1973@gongji.edu.cn

Shi Yuling,Email:shiyuling1973@gongji.edu.cn

ObjectiveTo investigate changes in expressions of activation antigens CD69 and HLA-DR in CD3+T lymphocytes in peripheral blood and skin lesions in patients with psoriasis vulgaris.MethodsPeripheral blood samples were obtained from 20 patients with psoriasis vulgaris and 20 healthy controls,and skin specimens from the lesions of 15 out of the 20 patients and 10 healthy controls.Flow cytometry was performed to quantify the expressions of CD69 and HLA-DR in peripheral blood CD3+T cells,and an immunohistochemical study to measure the expression of HLA-DR in skin specimens.Statistical analysis was carried out by a two-samplet-test and Pearson correlation analysis with the SPSS 19.0 software.ResultsCompared with the healthy controls,the patients with psoriasis vulgaris showed increased expression rates of CD69（4.70%±1.90%vs.1.56%±0.95%,t＝6.629,P＜0.01）and HLA-DR（8.97%± 1.79%vs.3.02% ±1.15%,t＝6.204,P＜0.01）in peripheral blood.Pearson correlation analysis revealed that the percentage of CD3+HLA-DR+cells in peripheral blood was positively correlated with the psoriasis area and severity index（PASI）score（r＝0.5626,P＜0.05）.The expression rate of HLA-DR was significantly higher in the dermis（64.87%± 17.31%vs.19.80%±5.69%,t＝7.916,P＜0.01）,but lower in the epidermis（11.80%±5.55%vs.27.40%±8.61%,t＝5.479,P＜0.01）in the psoriatic specimens compared with the control specimens.Immunohistochemically,HLA-DR was widely expressed in the dermis of psoriatic lesions,but mainly distributed around blood vessels in the control skin.ConclusionsThere is an aberrant activation of CD3+T cells in peripheral blood and inflammatory cells in skin lesions in patients with psoriasis vulgaris,and the percentage of CD3+HLA-DR+cells in peripheral blood is correlated with the severity of psoriasis vulagaris.

Psoriasis;Antigens,CD69;HLA-DR antigens;T-lymphocytes;Lymphocyte activation;Severity of illness index

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.09.008

國家自然科學(xué)基金（81301356）；上海市自然科學(xué)基金（13ZR1432200）；上海市科委科研計劃引導(dǎo)項目（134119b0700）

200072上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院皮膚科

史玉玲，Email：shiyuling1973@tongji.edu.cn

2014-12-31）

（本文編輯：尚淑賢）