桔梗總皂苷提取工藝優化*

李喜鳳，安碩，張偉曉，王優湑，賈永艷

(河南中醫學院藥學院，鄭州 450046)

桔梗為桔梗科植物桔梗[Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.]的干燥根[1]，是我國銷量最大的 40 種傳統中藥材之一。《神農本草經》記載，桔梗性平，味苦、辛，具有化痰止咳、利咽開音、宣暢肺氣、排膿消癰的功效[2]。桔梗的主要活性成分為桔梗皂苷[3]，具有抗低溫、抗高溫、抗毒、抗應激、抗放射、抗肥胖、抗腫瘤、抗水腫及利尿作用等，對增強細胞免疫和提高特異性抗體生成有一定作用，并對急性及慢性炎癥也有較強的抗炎作用。為了更好的開發利用桔梗皂苷，筆者本實驗采用正交實驗設計[4-5]和星點設計－效應面法[6-8]，優化桔梗總皂苷的提取工藝，并比較兩種實驗設計方法的優缺點，為充分利用桔梗藥材資源提供實驗參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2000型紫外分光光度儀(上海尤尼柯儀器有限公司)，YUEPINGFA2004b型電子分析天平(上海越平科學儀器有限公司，感量:0.01 mg)，KQ-100E型數控超聲清洗器(鞏義市英峪予華儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫療器械廠)。

1.2 試藥 桔梗飲片(湖北金貴中藥飲片有限公司，批號:131101);桔梗皂苷D(成都曼斯特生物科技有限公司，經高效液相色譜法測定，含量＞99.6%，批號:MUST-12082211);香草醛(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號:20120911);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 桔梗總皂苷含量測定

2.1.1 供試品溶液制備 取桔梗藥材15 g，按各實驗設計條件進行提取，合并提取液定容至250mL量瓶中。精密吸取5mL(相當于藥材量0.3 g)，水浴揮干，純化水溶解揮干所得物至20mL試管中，用水飽和的正丁醇萃取(4×20mL)，合并萃取液，回收正丁醇至干，殘渣用甲醇溶解轉移至10mL量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取桔梗皂苷D對照品3.87 mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.3 最大吸收波長的確定 精密移取對照品溶液0.4mL及供試品溶液0.2mL，于70℃水浴蒸發至干，加入 5%香草醛-冰醋酸 0.2mL，高氯酸 0.8mL，于60℃水浴保溫顯色15 min，冰水浴中冷卻5 min。加冰醋酸5mL，搖勻，立即在分光光度計波長400～800nm下掃描，同時空白溶液作參比。對照品及供試品的最大吸收波長均在478nm，故以478nm為測定波長。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8mL，置具塞試管中，于70 ℃水浴揮干，按測定方法同法處理，測定吸收值并回歸。以吸光度(A)為縱坐標，對照品質量為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程 A=1.49X+0.037，R2=0.9990。結果表明桔梗皂苷D 在0.03854～0.30836 mg范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度實驗 用同一對照品溶液，依“2.1.3”項下方法顯色測定吸光度，連續測定5次，結果RSD為0.24%，說明儀器的測試性能良好。

2.1.6 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0，10，20，30，40，50，60 min 進行測定，吸光度的RSD=0.26%，結果表明供試品溶液在60 min內基本穩定。

2.1.7 重復性實驗 按照供試品溶液制備項下方法平行6份制備，分別測定各樣品吸光度RSD=1.17%。

2.1.8 加樣回收率實驗 精確吸取9份已知含量的桔梗供試品溶液各1mL，分別精密加入桔梗皂苷D對照品適量，依“2.1.1”項方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項方法顯色后測定吸光度，計算回收率。結果見表1。平均加樣回收率為 99.71%，RSD為 1.72%(n=9)。

2.2 浸膏得率測定方法 精密吸取樣品液50mL，置已干燥至恒質量的蒸發皿中，水浴揮干，105℃真空干燥，至恒質量后于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量，計算，即得。

2.3 單因素實驗

2.3.1 乙醇濃度考察 準確稱取桔梗藥材6份，每份15 g，分別加 10倍量 50%，60%，70%，80%，90%乙醇回流提取2 h，濾過，濾液減壓濃縮，定容至100mL量瓶中，測定桔梗總皂苷的吸光度值，吸光度在乙醇濃度為70%時達到最大，當乙醇體積分數超過70%以后，吸光度值開始下降，所以選擇乙醇濃度70%為最佳。結果見圖1。

表1 桔梗皂苷D加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery test on kikyosaponin D

圖1 不同乙醇濃度對桔梗提取工藝的影響Fig.1 Effects of different concentration of ethanol on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.2 溶劑倍量考察 準確稱取桔梗藥材5份，每份15 g，分別加 4，6，8，10，12 倍量 70%乙醇提取 2 h，濾過，濾液減壓濃縮定溶至100mL量瓶中，測定桔梗總皂苷的吸光度值，結果見圖2。

2.3.3 提取時間考察 準確稱取桔梗藥材6份，每份15 g，加 10 倍量 70%乙醇，分別于30，60，90，120，150，180 min提取1次，濾過，濾液減壓濃縮，定容至100mL量瓶中，測定桔梗總皂苷的吸光度值，結果見圖3。

圖3 不同提取時間對桔梗提取工藝的影響Fig.3 Effects of different time of distillation on the extraction process of Platycodon grandiflorum

2.3.4 提取次數考察 準確稱取桔梗藥材15 g，加10倍量70%乙醇，提取3次，每次2 h，桔梗總皂苷第1次提取量占總量的絕大部分，前2次提取量占總提取量的比例為89.73%。故選擇提取2次。

2.4 桔梗回流提取工藝優化

2.4.1 正交實驗設計及結果分析 桔梗皂苷類成分可溶于水、甲醇，易溶于乙醇，本實驗采用乙醇回流法進行提取，根據單因素結果，選用乙醇濃度、溶劑倍量、提取時間、提取次數4個因素，每個因素選3個水平，用L9(34)正交實驗設計表安排實驗，以桔梗總皂苷的含量為主和干膏得率為輔來評價指標。實驗因素水平設計及實驗結果見表2～5。

表2 L9(34)實驗因素水平表Tab.2 Factors and levels of L9(34)experiment

結果分析如下。①直觀分析:根據極差R的大小，所考察4個因素對桔梗總皂苷含量的影響，顯著性大小為C＞D＞A＞B，即提取時間＞提取次數＞乙醇濃度＞溶劑用量。對干膏得率的影響，顯著性大小為A＞D＞B＞C，即乙醇濃度＞提取次數＞溶劑用量＞提取時間。②方差分析:對實驗數據進行方差分析。結果見表4和表5。分析結果表明，提取時間和提取次數對桔梗總皂苷收率有顯著影響，乙醇濃度對干膏得率具有顯著性影響。綜合直觀分析及工業生產中的實際情況，因此確定桔梗總皂苷的最佳提取工藝為6倍量70%的乙醇回流提取2次，每次180 min。

表3 L9(34)正交實驗表和結果Tab.3 L9(34)orthogonal experiment table and results

表4 桔梗總皂苷含量方差分析Tab.4 Variance analysis of the content of total saponins from Platycodon grandiflorum

表5 干膏得率方差分析Tab.5 Variance analysis on the yield of dry extract

驗證實驗:在確定優化工藝后，進行3次驗證實驗。結果見表6。

由表6可以看出，該提取工藝穩定、可靠，達到提取優化的目的。

表6 驗證實驗結果Tab.6 Results of verification test

2.4.2 星點實驗設計及結果 在單因素實驗基礎上，選取乙醇濃度(50%～90%)、溶劑倍量(6～12倍)、提取時間(30～200 min)為考察因素，由于提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，結合預實驗結果和工業生產實際，將提取數定為2次。按星點設計-效應面法三因素五水平表進行實驗，因素水平見表7，實驗安排及結果見表8。

表7 因素水平表Tab.7 Factors and levels

以總皂苷含量和干膏得率為評價指標，每個指標均標準化的用Hassan分別轉化為0～1的總評“歸一值(OD)”，按 OD=(d1×d2…dn)1/n(n 為指標數)計算，對取值越小越好的響應和取值越大越好的響應進行數學轉換求歸一值 dmin和 dmax，dmin=(Ymax－Yi)/(Ymax－Ymin)，dmax=(Yi－Ymin)/(Ymax－Ymin)[8]。在本實驗中，要求總皂苷的含量越高越好，干膏得率越小越好。

2.4.2.1 模型擬合 以各總評歸一值對自變量進行多元線性回歸和二項式擬合，運用統計分析軟件Statistica10.0，擬合方程如下，多元線性回歸方程:Y=－7.04524+0.0001X1+0.02559X2+0.9678X3，(r=0.7709)，F(3，6)=7.81。

二項式擬合方程為:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008－0.0006X1X2－0.0099X1X3－0.003X2X3(r=0.9799)。

從擬合方程的相關系數可見，多元線性回歸方程的相關系數較低，表示自變量與因變量之間線性相關性較差，多元線性回歸擬合度不佳，預測性較差，因此該數學模型不合適。多元二項式擬合方程相關系數較高，擬合效果較好。剔除不可信的b7、b8、b9進行重新擬合，得最終二項式數學模型:Y=－79.88+1.3102X1+0.2057X2+5.1150X3－0.008(r=0.9702)，簡化后方程的r值降幅很小，說明此方程可信度較高。采用ANOVA分析效應面的回歸參數。方差分析表見表9，結果表明提取時間和溶劑倍量二次項達極顯著水平(P＜0.0001)，方程的擬合度和可信度均較好，與實際情況擬合度良好，可以對不同條件下提取結果進行優化和預測。

表8 星點實驗設計與結果Tab.8 Central composite design and its results

2.4.2.2 效應面優化、預測 根據二次多項式模型，繪制各考察指標綜合得分與各自變量間的三維效應曲面圖。把因變量與另兩因素擬合為三維曲面圖，因只能表達含兩個因素變量的函數，故固定3個變量中的一個為中值，再以擬合的目標函數為數學模型，繪制因變量曲面圖和等高線(圖4～6)，在圖上選取較佳工藝范圍X1:65%～75%，X2:10～12倍，X3:120～170 min，綜合考慮工業生產中的實際情況，故選取提取桔梗中桔梗總皂苷的最佳工藝為:10倍量70%乙醇回流提取2次，每次140 min。

2.4.2.3 驗證實驗 根據最優工藝進行驗證實驗，實際總皂苷平均含量為33.86 mg·g－1(n=3)，實際值比預測值高1.02%。說明建立的數學模型可靠，預測性良好。

表9 回歸模型的方差分析Tab.9 Variance analysis on the regression model

圖4 乙醇濃度和提取時間對總評OD值的三維效應面圖及二維等高線圖Fig.4 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and distillation time versus total OD

圖5 乙醇濃度和溶劑倍量對總評OD值的三維效應面圖及二維等高線圖Fig.5 3D predicted response surface and 2D contour line of ethanol concentration and solvent volume versus total OD

3 討論

圖6 提取時間和溶劑倍量對總評OD值的三維效應面圖及二維等高線圖Fig.6 3D predicted response surface and 2D contour line of distillation time and solvent volume versus total OD

目前桔梗的提取工藝優化多采用正交設計方法，本實驗首次采用星點設計-效應面法對桔梗總皂苷進行提取工藝的考察，同時引入總評“歸一值”對多指標進行處理，從實驗結果可以看出，星點設計結合效應面優化法所得結果更加直觀、便于分析，更適合于探索的實驗研究，在最佳條件下效應的預測值和實測值偏差較小，且實驗結果精確度較高，在實驗設計中更有優勢，而正交設計受所選線性模型的限制，只能指出某一因素的取值方向，無法求得極值，往往選擇的條件均接近自變量的極大或極小值。綜上所述，星點設計-效應面法更適合于桔梗總皂苷的提取工藝，此實驗的研究為桔梗資源的進一步合理開發、利用奠定了基礎。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:259.

[2]宋楊，齊云.桔梗的藥理研究進展[J].中國藥房，2006，17(2):140－141.

[3]郭麗，張村，李麗，等.中藥桔梗的研究進展[J].中國中藥雜志，2007，32(3):181－185.

[4]楊壯，田景奎，張琳.比色法測定桔梗中桔梗總皂苷的含量[J].中國現代應用藥學，2008，25(1):58－61.

[5]桂雙英，王舉濤，葉杰勝，等.正交試驗法優選桔梗總皂苷的提取工藝[J].安徽中醫學院學報，2011，30(5):63－64.

[6]袁玉霞，關延彬，周寧，等.星點設計-效應面法優化復方左氧氟沙星原位凝膠的制備工藝[J].醫藥導報，2014，33(4).481－484.

[7]阮洪生，曹玲，陳志寶，等.星點設計-效應面法優選金蕎麥提取工藝[J].醫藥導報，2013，32(2):226－229.

[8]李媛，張龍，崔榮輝，等.星點設計-效應面法優選小兒健脾膏的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20(7):37－39.