米諾環(huán)素對老齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及認知功能障礙的影響*

劉九紅，韓嬙，遲曉慧，張濤，周碧云

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院麻醉學(xué)教研室，武漢 430030)

手術(shù)后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是麻醉手術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，尤其在老年患者中有較高的發(fā)生率[1]。POCD常持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，甚至引起永久性認知功能障礙，嚴重影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量和勞動能力，并增加社會醫(yī)療保障的負擔[2-3]。雖然POCD的確切病因尚不明確，但有研究表明，異氟烷引起的成年大鼠海馬神經(jīng)元凋亡可能是POCD的發(fā)病機制之一[4]。然而，目前臨床尚無有效措施防治。米諾環(huán)素是第2代四環(huán)素，是少數(shù)可通過血-腦脊液屏障的抗菌藥物。研究顯示，米諾環(huán)素可改善神經(jīng)退行性病變，如阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病的認知功能障礙;而減輕海馬神經(jīng)元凋亡是米諾環(huán)素發(fā)揮神經(jīng)保護作用的一種主要機制[5]。目前尚不清楚米諾環(huán)素是否可減輕異氟烷導(dǎo)致的老年大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，因此本研究擬探討米諾環(huán)素預(yù)給藥對異氟烷誘發(fā)老齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠45只，18～20個月，體質(zhì)量350～400 g。由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)證號:SCXK(鄂)2004-0007，實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2004-0007。動物飼養(yǎng)在溫度(22±1)℃、相對濕度(60±5)%、12 h明暗交替(7:00—19:00)的通風干燥環(huán)境，提供充足的標準化飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 試藥 異氟烷(美國 Baxter公司，批號:N008B008);米諾環(huán)素(美國 Sigma公司，批號:wxbb4793v);cleaved caspase 3抗體(美國CST公司，批號:12/2013);Bax抗體(美國Millipore公司，批號:2039768)及 Bcl-2抗體(美國 Millipore公司，批號:2383608);β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號:BM0627);caspase 3活性試劑盒(美國BD公司，批號:Bf3100)。

1.3 儀器 Biomedical全自動血氣分析儀(美國NOVA公司);Ethovision動物運動軌跡記錄系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司)。

1.4 動物選擇與分組 將大鼠放入麻醉箱中，麻醉箱放入35℃恒溫箱內(nèi)與麻醉機相連，以含有30%氧氣的空氧混合氣體作為載體氣體，通氣流量為2 L·min－1。采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為3組(n=15):空白對照組(C組)，異氟烷組(I組)和米諾環(huán)素+異氟烷組(M+I組)。異氟烷麻醉開始前12 h，M+I組腹腔注射米諾環(huán)素50 mg·kg－1。C組和I組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。C組大鼠給予30%氧氣-70%氮氣混合氣體4 h，I組和M+I組大鼠給予1.5%異氟烷4 h[6]。麻醉完成后，關(guān)閉異氟烷揮發(fā)罐，繼續(xù)保持通氣。

1.5 動脈血氣分析 麻醉結(jié)束后即刻每組取5只大鼠，用 32號針頭立即取左心室血液 200μL，采用Biomedical全自動血氣分析儀進行動脈血氣分析，測定血氣指標和血糖水平。

1.6 認知功能測定 每組其余10只大鼠待完全清醒后送回籠中，參考文獻[7]，于麻醉結(jié)束后第2天進行Morris水迷宮實驗。Ethovision動物運動軌跡記錄系統(tǒng)自動記錄大鼠游泳軌跡。以大鼠入水至爬上平臺的時間為逃避潛伏期，將60 s內(nèi)找不到平臺的大鼠放于平臺上休息15 s，逃避潛伏期記為60 s，取4次潛伏期的平均值，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄逃避潛伏期。于第5天將平臺撤去，以大鼠60 s內(nèi)在平臺所在象限的停留時間為探索時間，記錄探索時間。

1.7 Western blot檢測cleaved caspase 3蛋白等活性及表達 水迷宮試驗后，斷頭，于冰上分離海馬組織，去除腦膜和血管，稱定質(zhì)量后裂解，提取總蛋白，采用Western blot法檢測海馬組織cleaved caspase3蛋白表達。采用 Image Lab 3.0版軟件進行灰度分析。以cleaved caspase 3、Bax或Bcl-2與β-actin灰度值的比值反映其表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS Statistics 20版統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA);Morris水迷宮逃逸潛伏期數(shù)據(jù)采用連續(xù)測量的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血氣分析指標 3組大鼠血液pH值、二氧化碳分壓(PaCO2)、氧分壓(PaO2)及血糖值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表 1。

2.2 認知功能影響 與C組比較，I組第3～4天時逃避潛伏期延長，目標象限時間比例減少(P＜0.05);與I組比較，M+I組第3～4天時逃避潛伏期縮短，目標象限時間比例增加 (P＜0.05)，見表2。

2.3 caspase 3活性及表達 與C組比較，I組caspase 3活性增強，cleaved caspase 3表達升高 (P＜0.05);與I組比較，M+I組 caspase 3活性顯著降低，cleaved caspase 3 表達顯著降低 (P＜0.05)，見圖 1。

2.4 凋亡因子表達 與C組比較，I組Bax表達升高，Bcl-2表達降低 (P＜0.05);與 I組比較，M+I組 Bax表達降低，Bcl-2 表達升高(P＜0.05)，見圖 2。

3 討論

1.5 %異氟烷與臨床麻醉所用的濃度相接近。目前研究認為1.5%異氟烷處理2，4或者6 h都可引起海馬神經(jīng)元凋亡及認知功能障礙[8]。因此本研究選擇1.5%異氟烷麻醉4 h建立異氟烷誘發(fā)老齡大鼠認知功能障礙模型。海馬是大腦中的重要組成部分，在學(xué)習和記憶中扮演重要角色，認為與POCD密切相關(guān)[9]。故本研究選擇海馬組織作為評價POCD的觀察對象。

米諾環(huán)素是四環(huán)素衍生物，具有高度親脂性，能有效透過血-腦屏障。近年來研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素除了具有抗感染能力之外，還具有抗凋亡、抗炎及神經(jīng)保護等作用[5]，能改善創(chuàng)傷性腦損害認知功能障礙[10]。米諾環(huán)素半衰期約為12 h，因此本研究中選擇術(shù)前12 h腹腔給予米諾環(huán)素預(yù)處理。本實驗過程中，3組生理指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明本實驗中異氟烷和米諾環(huán)素對循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)都未造成明顯的抑制作用。

Morris水迷宮是目前研究認知功能公認的試驗方法[7]。本研究表明，與C組比較，I組第3～4天時逃避潛伏期延長，目標象限時間比例降低，提示異氟烷麻醉4 h可導(dǎo)致老齡大鼠發(fā)生認知功能障礙。與I組比較，M+I組第3～4天時逃避潛伏期縮短，目標象限時間比例降低，提示米諾環(huán)素預(yù)處理可改善異氟烷麻醉誘發(fā)老齡大鼠認知功能障礙。

研究表明，米諾環(huán)素確能減少腦缺血-再灌注損傷過程中的細胞凋亡，caspase 3的表達下調(diào)可能是其重要的機制之一[11]。本研究得到類似結(jié)果，米諾環(huán)素降低異氟烷誘導(dǎo)的老齡大鼠海馬神經(jīng)元caspase 3活性及表達上調(diào)。

B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2，Bcl-2)是Bcl家族中最主要的的凋亡抑制因子，起著抑制凋亡的作用。在視神經(jīng)橫斷模型中，米諾環(huán)素的神經(jīng)保護作用與抑制促凋亡因子Bax、上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素減輕異氟烷所致Bax表達上調(diào)、Bcl-2表達下調(diào)，這提示米諾環(huán)素減輕老齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

表1 3組大鼠動脈血氣指標和血糖水平比較Tab.1 Comparison of arterial gas analysis parameters and blood glucose among three groups of rats n=5，

表1 3組大鼠動脈血氣指標和血糖水平比較Tab.1 Comparison of arterial gas analysis parameters and blood glucose among three groups of rats n=5，

組別 pH值PaCO2 PaO2 kPa葡萄糖/(mmol·L－1)SaO2/%C 組 7.31±0.05 4.815±0.572 14.364±1.862 4.5±0.4 99.0±1.0 I 組 7.33±0.06 4.788±0.359 14.098±1.729 4.4±0.7 97.0±0.8 M+I 組 7.35±0.06 5.214±0.479 13.832±1.463 4.1±0.5 98.0±0.5

表2 3組大鼠認知功能的比較Tab.2 Comparison of cognitive function among three groups of rats s，，n=10

表2 3組大鼠認知功能的比較Tab.2 Comparison of cognitive function among three groups of rats s，，n=10

與 C 組比較，F(xiàn)=28.363，43.462，7.764，39.542，*1 P＜0.05;與 I組比較，F(xiàn)=30.592，31.558，21.547，42.279，*2 P＜0.05Compared with group C，F(xiàn)=28.363，43.462，7.764，39.542，*1 P＜0.05;compared with group I，F(xiàn)=30.592，31.558，21.547，42.279，*2 P＜0.05.

組別 逃避潛伏期第1天 第2天 第3天 第4天目標象限時間比例/%C 組 50±4 40±3 29±6 24±4 45±5 I組 54±5 52±6*1 48±7*1 43±6*1 22±5*1 M+I組 51±3 45±3*2 35±8*2 30±5*2 42±6*2

A.caspase 3活性;B.cleaved caspase 3 表達;與 C 組比較，t=13.077，11.478，*1 P＜0.05，與 I組比較，t=24.409，24.884，*2 P＜0.05圖1 3組大鼠的caspase 3活性和cleaved caspase 3表達A.caspase 3 activity;B.cleaved caspase 3 expression;Compared with group C，t=13.077，11.478，*1 P＜0.05;Compared with group I，t=24.409，24.884，*2 P＜0.05.Fig.1 Caspase3 activity and cleaved caspase 3 expression in three groups

A.Bax表達;B.Bcl-2 表達;與 C 組比較，t=7.098，7.0437，*1 P＜0.05;與 I組比較，t=10.129，9.648，*2 P＜0.05圖2 3組大鼠Bax和Bcl-2表達A.Bax expression;B.Bcl-2 expression;Compared with group C，t=7.098，7.0437，*1 P＜0.05;Compared with group I，t=10.129，9.648，*2 P＜0.05Fig.2 Protein expression of Bax and Bcl-2 in three groups

綜上所述，米諾環(huán)素減輕臨床相關(guān)濃度異氟烷所致的老齡大鼠認知功能障礙，其機制與米諾環(huán)素減輕異氟烷誘發(fā)的老齡大鼠海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。米諾環(huán)素價格便宜、安全性較高，有望用于臨床預(yù)防和治療POCD。

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