復方功能制劑對改善小鼠記憶功能的影響

羅麗華，楊昌林，杜　鵬，張　琳，王若永，李　彤，穆慧玲（.空軍航空醫(yī)學研究所，北京004；.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱50040）

復方功能制劑對改善小鼠記憶功能的影響

羅麗華1，楊昌林1，杜鵬1，張琳2，王若永1，李彤1，穆慧玲1
（1.空軍航空醫(yī)學研究所，北京100142；2.東北林業(yè)大學，黑龍江哈爾濱150040）

為研究?；撬?、咖啡因、人參皂甙復方功能制劑在改善記憶方面的功能，選取雄性昆明小鼠40只，隨機分為空白對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。低、中、高劑量組每天分別灌胃給予復方功能制劑41、80和237 mg/kg BW，空白對照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水，共灌胃30 d。末次灌胃后次日將4組小鼠按跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗、Morris水迷宮實驗順次進行實驗，比較組間各項觀察指標的差異。研究結果表明，中、高劑量組跳臺實驗記憶鞏固潛伏期顯著延長（p＜0.05），低、中、高劑量組穿梭實驗不同訓練周期的主動/被動回避時間、水迷宮實驗的對位探查實驗均有顯著性差異（p＜0.05）。提示本復方功能制劑能顯著改善小鼠的學習記憶能力，具有改善記憶功能。

?；撬?，咖啡因，人參皂甙，記憶，改善記憶功能

記憶是一個極其復雜的心理、生理和生化過程，涉及神經(jīng)營養(yǎng)、突觸形態(tài)和功能、中樞神經(jīng)遞質及受體、Ca2+濃度、細胞凋亡及相關基因表達、信號轉導等改變。近年來，國內外對改善記憶功能進行了大量的研究，結果表明多種氨基酸、多不飽和脂肪酸、微量營養(yǎng)素及多種植物化學物等均具有改善記憶的生物學作用，如牛磺酸、人參皂甙、咖啡因、魚油、卵磷脂、酪氨酸、鋅等［1-5］，單一功能成分或復方制劑均有改善記憶的功能［6-7］。?；撬崾侵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)含量豐富的游離氨基酸，可通過多種渠道來影響認知功能［8］；人參皂甙是我國傳統(tǒng)的滋補養(yǎng)生名貴藥材人參的主要功效成分，長期臨床實踐證明人參皂甙具有多靶點、多環(huán)節(jié)綜合促進學習記憶的作用［9］；而咖啡因是目前世界上使用最廣泛的精神興奮性類物質，具有興奮心臟、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用，對維持警醒、緩解疲勞具有顯著作用［10-13］。三種功能成分均具有效果明確、療效顯著、食用安全等特點。為進一步探討該功能成分的協(xié)同效應，研制一種安全、高效的改善記憶功能制劑，本研究優(yōu)選?；撬?、咖啡因、人參皂甙作為功效成分進行組方，按照國家衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）［14］要求，采用小鼠記憶實驗模型，對其改善記憶功能進行研究，以期為研制改善認知和記憶的功能食品打下基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

復方功能制劑由空軍航空醫(yī)學研究所營養(yǎng)與特種食品研發(fā)中心研制；?；撬幔舛?9.56%）、咖啡因（濃度98.96%）及人參皂苷（濃度80.31%） 均購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

YLS-3TB型跳臺記錄儀、YLS-17B型避暗穿梭測試儀濟南益延科技發(fā)展有限公司；XR-XR101型Morris水迷宮、XR-Xmaze型動物行為分析軟件上海欣軟信息科技有限公司。

1.2實驗動物及分組

昆明小鼠40只，體重（20±2）g，雄性。飼養(yǎng)環(huán)境為全屏障清潔級動物實驗室，溫度（22±2）℃，相對濕度（50%±5%），12～12 h光照及黑暗環(huán)境循環(huán)。喂飼全價營養(yǎng)顆粒飼料。實驗動物和飼料均由吉林省長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。實驗動物合格證號0021281，實驗動物使用許可證號SCXK-（吉）2011-0004。實驗前適應性飼養(yǎng)3 d。

將實驗用小鼠按體重隨機分為4組：低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白對照組，每組10只。實驗前夜禁食不禁水。按照人體推薦量咖啡因300 mg/人·日、?；撬?00 mg/人·日、西洋參總皂苷50 mg/人·日，以標準人體重為70 kg進行換算，計算得出相當于人體推薦量的5倍為低劑量組、10倍為中劑量組、30倍為高劑量組，每天分別灌胃給予牛磺酸、咖啡因和人參皂甙復方制劑41、80和237 mg/kg BW，空白對照組每天灌胃給予同體積的蒸餾水，共灌胃30 d。

表1　小鼠跳臺實驗記憶獲得與鞏固的結果Table 1　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step down test

1.3實驗方法及檢測指標

受試樣品給予時間為30 d，給藥第1 d稱量小鼠體重一次，根據(jù)體重按0.4 mL/20 g折算成給藥體積，之后每7 d稱量一次，根據(jù)體重的變化調整給藥體積。根據(jù)國家衛(wèi)生部頒發(fā)的《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）［14］方法將4組小鼠按跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗、Morris水迷宮實驗順次進行實驗，比較組間各項指標的差異。

1.3.1跳臺實驗、避暗實驗、穿梭箱實驗方法參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）［14］。

1.3.2Morris水迷宮實驗參照《保健食品功能范圍調整方案（2011年8月上網(wǎng)征求意見稿）》［15］中新的水迷宮方法Morris水迷宮實驗進行，新標準中未描述新方法的實驗步驟和檢測指標，本實驗內容參照Morris水迷宮生產(chǎn)廠家提供的實驗方法進行實驗。將水池分為4個象限，平臺置于其中一個象限區(qū)的中央。將小鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機取東、西、南、北四個起始位置之一。在前幾次訓練中，如果在60 s內未找到平臺，則引導小鼠到平臺，停留10 s。獲得性訓練分3 d進行共16次（第1 d 4次，第2、3 d每天6次，每次訓練之間間隔5～10 min）。最后一次獲得性訓練結束后第2 d，開始探查訓練。將平臺撤除，開始60s的探查訓練。將小鼠由原先平臺象限的對側放入水中。記錄小鼠進入目標象限（原放置平臺的象限）所花時間和次數(shù)。

在探查訓練結束后第2 d，開始3 d的對位訓練。即將平臺放在原平臺所在象限的對側象限，方法與獲得性訓練相同。最后一次對位訓練的第2 d進行對位探查訓練，方法同探查訓練。記錄小鼠60 s內進入目標象限（平臺第二次所在區(qū)）所花時間和進入該區(qū)的次數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個處理重復2次，通過SAS 9.20軟件計算平均值和標準差并進行統(tǒng)計分析。首先進行方差齊性檢驗（F檢驗），方差齊，用T檢驗進行統(tǒng)計；方差不齊，用秩和檢驗進行統(tǒng)計。跳臺實驗、避暗實驗錯誤次數(shù)和動物數(shù)用χ2檢驗進行統(tǒng)計。以p＜0.05為差異性顯著，p＜0.01為差異性非常顯著。

表2　小鼠跳臺實驗記憶再現(xiàn)-消退實驗結果Table 2　Results of memory retrieval-extinction in mice from step down test

2　結果與分析

2.1復方功能制劑對小鼠跳臺實驗的影響

由表1和表2可知，記憶鞏固實驗中、高劑量組與對照組比較，潛伏期明顯延長，具有顯著性差異（p＜0.05）。其他結果未見顯著統(tǒng)計學差異。小鼠跳臺實驗是測量改善實驗動物記憶的常用實驗方法。實驗結果中，中、高劑量組小鼠記憶鞏固潛伏期明顯延長，說明小鼠記憶保持時間增加，提示中、高劑量組的復方功能制劑對小鼠記憶鞏固過程有促進作用。

2.2復方功能制劑對小鼠避暗實驗的影響

結果見表3和表4。避暗實驗中，記憶獲得和記憶再現(xiàn)-消退實驗各實驗組均未見顯著性差異。

表3　小鼠避暗實驗記憶獲得與鞏固的結果Table 3　Results of memory acquisition and consolidation in mice from step through test

表4　小鼠避暗實驗記憶再現(xiàn)-消退的結果Table 4　Results of memory retrieval-extinction in mice from step through test

表5　小鼠穿梭實驗主動/被動回避時間的結果Table 5　Results of the active and passive evading time in mice from shuttle box test

2.3復方功能制劑對小鼠穿梭實驗的影響

由表5可知，低劑量組與對照組比較，第3 d訓練的主動/被動回避時間顯著縮短（p＜0.05）；中劑量組與對照組比較，在第1 d和第3 d訓練的主動/被動回避時間顯著縮短（p＜0.05）；高劑量組與對照組比較，在第3 d訓練的主動/被動回避時間顯著縮短（p＜0.05）。

表6　小鼠水迷宮實驗探查和對位探查實驗結果Table 6　Results of the exploring and counterpoint exploring time in mice from water maze test

穿梭實驗可用于檢測實驗動物記憶改善情況。與對照組比較，低、高劑量組在第3 d、中劑量組在第1 d和第3 d的主動/被動回避時間均有顯著性差異（p＜0.05），提示低、中、高劑量組的復方功能制劑對小鼠記憶均有一定的改善作用。

2.4復方功能制劑對小鼠Morris水迷宮實驗的影響

Morris水迷宮是一種研究與海馬功能直接相關的空間學習記憶模型，能較準確地反映動物的空間學習記憶能力。由表6可知，在對位探查實驗中，低、中、高劑量組與對照組比較，對位探查實驗有顯著性差異（p＜0.05），其中中劑量組60 s內進入目標象限次數(shù)顯著增加（p＜0.05），提示低、中、高劑量組的復方功能制劑能明顯地提高小鼠的空間辨別能力或空間辨別的記憶再現(xiàn)能力。

3　結論

小鼠跳臺實驗、避暗實驗、穿梭實驗以及Morris水迷宮是常用的研究記憶改善功能的動物實驗。本研究采用上述四項實驗，結果表明，低劑量組穿梭實驗、水迷宮實驗結果陽性，中劑量組跳臺實驗、穿梭實驗、水迷宮實驗結果均為陽性，高劑量組跳臺實驗、穿梭實驗、水迷宮實驗結果均為陽性。提示?；撬?、咖啡因、人參皂甙復方功能制劑對小鼠的學習記憶功能有明顯改善作用。

［1］夏薇，趙秀娟，孫彩虹.?；撬?、鋅及卵磷脂對改善記憶聯(lián)合作用［J］.中國公共衛(wèi)生，2006，22（10）：1251.

［2］張靜姝.深海魚油輔助改善記憶功能的研究［D］.天津：天津醫(yī)科大學，2011.

［3］Yurko-Mauro K，McCarthy D，Rom D，et al.Beneficial effects of docosahexaenoic acid on cognition in age-related cognitive decline［J］.Alzheimers Dement，2010，12，6（6）：456-64.［4］Agnew-Blais JC，Wassertheil-Smoller S，Kang JH，et al. Folate，Vitamin B-6，and Vitamin B-12 Intake and Mild Cognitive Impairment and Probable Dementia in the Women’s Health Initiative Memory Study［J］.J Acad Nutr Diet，2014，9（5）：S2212-S2672.

［5］池莉平，朱展鷹，黃俊明，等.大豆卵磷脂改善記憶作用動物實驗研究［J］.中國熱帶醫(yī)學，2006，6（11）：1945-1946.

［6］杜正彩，鄧家剛.復方絞股藍益智顆粒改善記憶作用藥效學研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（15）：250-253.

［7］萬文斌，趙明星，董振華，等.益智防呆方對學習記憶障礙小鼠的行為學影響［J］.成都醫(yī)學院學報，2012，7（3）：363-366.

［8］張文革，王勇，仲崇斌，等.?；撬釋W習記憶影響的研究現(xiàn)狀［J］.生物學雜志，2004，21（1）：1-5.

［9］劉穎，李璽，袁海峰，等.人參皂甙Rg1促進學習記憶作用研究進展［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2006，26（10）：956-960.

［10］李海霞，陳榕，周丹，等.咖啡因的合成及其藥理作用的研究進展［J］.華西藥學雜志，2011，26（2）：182-187.

［11］Green HJ，Symon S，Daley R.Attenuation of human quadriceps fatigue with caffeine［J］.Can J Appl Sports，1990，15：115.

［12］Johnson Kozlow M，Kritz-Silverstein D，Barrett-Connor E，et al．Coffee consumption and cognitive function among older adults［J］．Am J Epidemiol，2002，156（9）：842-850.

［13］夏譽，武志偉，尉曉娜，等.咖啡因對慢性刺激過程中小鼠行為和學習記憶的影響［J］.醫(yī)學研究雜志，2012，41（5）：80-83.

［14］衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.保健食品檢驗與評價技術規(guī)范［S］.北京：國家衛(wèi)生部，2003：93.

［15］衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.保健食品功能范圍調整方案（征求意見稿）［EB］.北京：國家衛(wèi)生部，2011.

Effect of the compound preparation on improving the memory of mice

LUO Li-hua1，YANG Chang-lin1，DU Peng1，ZHANG Lin2，WANG Ruo-yong1，LI Tong1，MU Hui-ling1
（1.Institute of Aviation Medicine，Air Force，Beijing 100142，China；2.Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

This study was designed to evaluate effects of taurine，caffeine and ginsenosides compound preparation on improving the memory of mice.Forty Kunming male mice were randomly divided into four groups，including groups of low-dosage，medium-dosage，high-dosage and control（each with n=10）.The low，medium and high dosage groups were given 41，80 and 237 mg/kg BW of compound preparation respectively through intragastric intubation daily for 30 days.The control group was given the same volume of distilled water at the same time.Experiments of step-down test，step through test，shuttle box test and Morris water maze test were conducted in order after the last intubation.The differences between each group were compared.Results indicated that the memory consolidation latent period of medium and high dosage groups were prolonged significantly in step down test（p＜0.05）.In shuttle box test，the active and passive evading time of the low，median and high dosage groups in all training cycles shortened（p＜0.05）.In water maze test，the counterpoint exploring time also were shortened（p＜0.05）.In conclusion，the compound preparation could improve significantly the learning and memory ability of mice.The results indicated that the compound preparation had memory improving effect.

taurine；caffeine；ginsenosides；memory；memory improving effect

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0367-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.066

2014－08－15

羅麗華（1964-），女，碩士，研究員，研究方向：營養(yǎng)與功能食品，E-mail：lll333@sina.com。

“十二五”全軍后勤科研重點項目（BX111C017）。