響應面法在香菇液體種生產工藝優化中的應用

陳文強，喬艷明（.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

響應面法在香菇液體種生產工藝優化中的應用

陳文強1，2，喬艷明1
（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

以香菇菌絲體生物轉化量為主要指標，首先用單因素實驗篩選出適合香菇南山1號菌絲生長的最佳碳、氮源，在此基礎上利用Minitab 15軟件做Plackett-Burman設計實驗，篩選出對菌絲生物轉化量影響顯著的因子：玉米粉、麥麩、MgSO4·7H2O和接種量；然后進行最陡爬坡實驗，選出最佳響應區域，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken模式做4因素3水平響應面分析實驗，得到最優的液體種生產工藝條件：玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min搖床發酵10 d，此條件下菌絲生物轉化量可達51.004 g/L。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明響應面法用于香菇液體菌種生產優化是可行的，數學模型的預測值與實驗觀察值相符。

香菇，液體種，響應面，優化

香菇（Lentinus edodes）隸屬于擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬，又名香菇菌、花菇、花蕈等，是一種重要的真菌［1］。香菇含有豐富的人體必需氨基酸，不飽和脂肪酸比重大，并且含有6大酶類中的40多種酶［2］。其不僅是人們理想的美味佳肴，而且具有較高的營養價值，其保健藥用功能也越來越受到人們的重視［3-6］。

近年來，液體深層發酵技術用于食用菌液體種的生產和制備，越來越受到人們重視［7-8］，是由于該技術比之傳統的食用菌生產方法有明顯的優越性［9］。因為此技術在短期內就能獲得大量的菌絲體或菌種，液體菌種接入固體培養料時，又具有流動快，易分散，萌發快，發菌點多等特點，使袋栽食用菌接種污染得到有效的控制。因此，食用菌研究工作者認為深層發酵生產是食用菌發展的方向［10-11］。香菇作為食用菌生產的支柱產業之一，其液體種的生產工藝是提高香菇生產效率的關鍵。

目前，響應面法在其液體種生產工藝條件優化中的應用方面尚無研究報道，并且由于菌種和培養條件等因素的差異，所得到香菇菌絲生物轉化量差別較大。張安寧等［12］對香菇933菌株液體發酵條件進行優化實驗，所得菌絲生物轉化量僅為17.76 g/L。梁寶東等［13］采用正交實驗對香菇856菌株培養基及發酵條件進行優化，所得菌絲生物轉化量為78.4 g/L。

本研究采用香菇南山1號菌株為材料，在單因素實驗基礎上，利用響應面分析法對香菇液體種的生產工藝進行優化，旨在為香菇液體種的工業化制備和生產提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香菇南山1號菌株陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4NO3均為分析純；VB1山西津華暉星制藥有限公司；瓊脂、牛肉粉、酵母粉、蛋白胨北京奧博星生物技術有限責任公司；麥芽糖中國科學院上海生物化學研究所；麥麩、紅糖、蔗糖、玉米粉（均為食品級）市售；實驗用水為純化水；斜面培養基（CPDA） 土豆（去皮）200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO45.0 g、MgSO4·7H2O 3.0 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、瓊脂12.0 g、初始pH自然；母種培養基牛肉粉10.0 g、麥麩10.0 g、紅糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、初始pH自然；碳源篩選培養基葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、紅糖各為20.0 g，玉米粉10.0 g、酵母粉2.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、初始pH自然；氮源篩選培養基酵母粉、蛋白胨、牛肉粉、NH4NO3各為2.0 g，麥麩10.0 g、紅糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、初始pH自然。

LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋上海醫用核子儀器廠；TB-214型電子分析天平北京賽得利斯儀器系統有限公司；MDF-U32V型超低溫冷凍冰箱日本三洋電器集團；Q/BKYY31-2000型電恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療器械廠；LRH-250-GS型數顯式恒溫培養箱廣東省醫療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；ZHWY-210 2C型數顯式恒溫搖床上海志成有限公司；SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株活化配制CPDA培養基，接種香菇南山1號菌株，28℃培養，待菌株滿管后，4℃冰箱保藏備用。

1.2.2液體母種的制備配制母種培養基，取香菇南山1號0.5 cm2菌塊接種于母種培養基中，靜置24 h，28℃、170 r/min振蕩培養10 d備用。

1.2.3生物轉化量的測定將液體條件下培養好的香菇菌絲體抽濾至不滴水，電子分析天平稱重。計算式：菌絲球生物轉化量=香菇菌絲球濕重（g）/培養液總體積（L）

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1碳源篩選實驗在碳源篩選培養基中，用10.0 g玉米粉分別與麥芽糖、紅糖、蔗糖和葡萄糖各20.0 g組合作為碳源，配制培養基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24 h，28℃、160 r/min條件下培養10 d，每種培養基3個重復，測定菌絲生物轉化量，求平均值，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳碳源組合作為Plackett-Burman設計考慮因素。

1.2.4.2氮源篩選實驗在氮源篩選培養基中，用10.0 g麥麩分別與酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0 g組合作為氮源，配制培養基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24 h，28℃、160 r/min條件下培養10 d，每種培養基3個重復，測定菌絲生物轉化量，求平均值，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳氮源組合作為Plackett-Burman設計考慮因素。

1.2.5Plackett-Burman設計實驗根據單因素實驗結果，選取11個因素（紅糖、玉米粉、麥麩、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1、初始pH、接種量、溫度、振蕩速度）作為研究對象，進行Plackett-Burman設計實驗，按照表1和表5配制培養基，接液體母種，靜置24 h，振蕩培養10 d，每組實驗設3個重復，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉化量，求平均值，借助Minitab 15軟件對數據進行統計分析。

1.2.6最陡爬坡實驗根據Plackett-Burman實驗結果，以及各個顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向進行實驗。針對影響顯著因素進行最陡爬坡實驗，將正效應的值逐步增加，負效應的值逐步減小，設計實驗找出峰值，以尋找快速最佳的響應區域。每種培養基設3個重復，接種后靜置24 h，振蕩培養10 d，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉化量。

表1　Plackett-Burman實驗設計各因素及水平Table 1　The factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.7Box-Behnken實驗設計與分析根據上述實驗，以菌絲生物轉化量為響應值，采用玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）進行四因素三水平的Box-Behnken實驗設計，因素與水平編碼見表2。

表2　Box-Behnken實驗設計Table 2　Box-Behnken experimental design

1.2.8數據處理與分析采用Minitab 15軟件和Excel數據分析工具中的t-檢驗（雙樣本異方差假設）對Plackett-Burman實驗結果進行分析，并采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken實驗結果進行分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1不同碳源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行實驗，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，結果見表3。

表3　不同碳源對香菇菌絲體生長的影響Table 3　Effect of different carbon source on the mycelial biomass of Lentinus edodes

表3結果表明，不同碳源對香菇菌絲體生長的生物轉化量不同，其中以紅糖和玉米粉組合最好，菌絲生物轉化量最高。以麥芽糖和玉米粉組合也顯現出較高的生物轉化量，葡萄糖和玉米粉組合的菌絲生物轉化量最低。根據不同碳源組合培養基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉化量，可確定紅糖與玉米粉組合為最佳碳源，菌絲生物轉化量為27.322 g/L。

2.1.2不同氮源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行實驗，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，結果見表4。

表4　不同氮源對香菇菌絲體生長的影響Table 4　Effect of different nitrogen source on the mycelial biomass of Lentinus edodes

表4結果表明，不同氮源對香菇菌絲體生長的生物轉化量不同，其中以牛肉粉和麥麩組合最好，菌絲生物轉化量高。以酵母粉和麥麩組合作為氮源也顯現出較高的生物轉化量，NH4NO3和麥麩組合的菌絲生物轉化量最低。根據不同氮源組合培養基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉化量，可確定牛肉粉與麥麩組合為最佳氮源，菌絲生物轉化量為30.343 g/L。

2.2Plackett-Burman設計實驗

選用實驗次數n=12的Plackett-Burman實驗設計，考察X1（紅糖）、X2（玉米粉）等11個因素，根據前期實驗結果，每個因素取兩水平，以菌絲生物轉化量Y為響應值。同時借助Minitab 15軟件對實驗結果進行統計分析，并通過t-檢驗從11個因素中選出了4個最顯著影響因素，結果見表5和表6。

表5　Plackett-Burman實驗設計及響應值Table 5　Plackett-Burman experiment design and its response

表6　Plackett-Burman實驗方差分析結果Table 6　ANOVA results of Plackett-Burman experiment design

表5和表6結果表明，對香菇菌絲生物轉化量影響的顯著因素：玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的時候，菌絲生物轉化量的值明顯增加，為正效應因素。而X6在量增多的時候，菌絲生物轉化量反而降低，因此X6為負效應因素。

2.3最陡爬坡實驗

響應面擬合只有在鄰近最大響應區域后才能最好地反映出真實情況，故要先逼近最佳響應區域。根據Plackett-Burman實驗結果，將玉米粉（X2）、麥麩（X3）和接種量（X11）的值逐步增加，MgSO4·7H2O（X6）的值逐步減小。根據Minitab 15軟件實驗分析，其他因素取高水平，結果見表7。

表7　最陡爬坡實驗設計及結果Table 7　Steepest ascent experimental design and results

表7結果表明，在玉米粉24.0 g/L，麥麩14.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.1 g/L，接種量14.0%時，測得香菇菌絲生物轉化量最大為29.214 g/L，所以此為最佳響應區域。

2.4Box-Behnken實驗設計與分析

按照表2中因素水平，借助Design-Expert 8.0.6軟件進行四因素三水平Box-Behnken實驗設計，結果見表8。

表8　Box-Behnken中心組合因素水平編碼表Table 8　Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

2.5回歸模型方差分析結果

經Design-Expert 8.0.6軟件，以玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）為響應變量，以菌絲生物轉化量（Y）為響應值對表8結果進行處理，得到表9回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性的二次多項式擬合，得到預測模型如下：

表9結果表明，X3、X6、X11、X2X11、X3X6、X62項顯著；X2項極顯著，其他X2X3、X2X6、X3X11、X6X11、X22、X32、X112不顯著。模型p值小于0.0001，可信度水平大于99.99%，說明該模型有意義，所擬合的二次回歸方程合適。該模型失擬項p值為0.3456＞0.05，失擬項不顯著，說明實驗操作可信，實驗理論可使用。另外從F值可看出這四個因素對菌絲生物轉化量的影響順序：X2＞X11＞X6＞X3，即玉米粉＞接種量＞MgSO4·7H2O＞麥麩。

2.6響應面及等高值分析結果

根據回歸方程繪制菌絲生物轉化量隨各因素變化的響應曲面圖，由響應曲面圖可知玉米粉、麥麩、MgSO4·7H2O、接種量4個因素對香菇菌絲生物轉化量的影響（圖1、圖2）。每個響應曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用，其余兩個因素保持在編碼水平的0水平。

圖1結果顯示，在一定接種量條件下，隨著玉米粉含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較低條件下，隨著接種量的增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較高條件下，接種量對香菇菌絲生物轉化量影響不明顯。

圖2結果顯示，在低硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在高硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈下降趨勢；在低麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈上升趨勢；在高麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉化量呈下降趨勢。

在實際生產過程中，為了降低成本，盡可能使用有機廉價的原料，所以在“criteria”選項中選擇MgSO4·7H2O為最小值，玉米粉、接種量、麥麩為平均值，香菇菌絲生物轉化量為最大值，利用Design-Expert 8.0.6得到香菇南山1號菌株液體種的最優生產工藝條件：玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH 6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min振蕩發酵10 d，菌絲生物轉化量擬合值為49.956 g/L。

表9　回歸分析結果Table 9　Result of regression analysis

圖1　菌絲生物轉化量在接種量和玉米粉交互影響下的響應面以及等高值線圖Fig.1　Mycelial wet weight values of the response surface and contour charts in inoculation quantity and corn flour

圖2　菌絲生物轉化量在麥麩和MgSO4·7H2O交互影響下的響應面以及等高值線圖Fig.2　Mycelial wet weight values of the response surface and contour charts in wheat bran and MgSO4·7H2O

2.7驗證實驗

根據最優生產工藝條件參數對模型進行驗證，繼續發酵培養，最終得到香菇菌絲生物轉化量為51.004 g/L，在初始培養條件下菌絲生物轉化量為29.214 g/L，優化后提高了1.75倍。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。該結果表明，響應面法優化香菇液體種最佳生產工藝條件是可行有效的。

3　結論

在單因素實驗的基礎上，通過響應面分析法對香菇南山1號菌株液體種生產工藝條件進行了優化，并得到回歸方程，表明玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）對響應值均有顯著影響，接種量和玉米粉、麥麩和MgSO4·7H2O交互作用顯著。經回歸分析并結合生產實際，確定香菇南山1號菌株的液體種生產工藝條件為玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min搖床發酵10 d，此條件下菌絲生物轉化量為51.004 g/L，比之前得到大幅度提高。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明該模型可靠性較高，能很好地預測實驗結果。相比現有報道，本研究所得香菇菌絲生物轉化量較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產工藝簡單且成本參考文獻

低，可為香菇南山1號菌株的液體種生產和栽培提供理論參考。

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Application of response surface for the optimization of liquid seed production process of Lentinus edodes

CHEN Wen-qiang1，2，QIAO Yan-ming1
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723000，China）

Adopting mycelial biomass of Lentinus edodes（Berk.）Sing as major index，different carbon and nitrogen source on the L.edodes（‘Nanshan NO.1’）mycelial growth were used in the single factor test.The important factors influencing mycelial biomass of L.edodes which identified by initial experimental design of Plackett-Burman were corn flour，wheat bran，MgSO4·7H2O and inoculation quantity.The path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the four significant factors.Box-Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring the optimal L.edodes liquid seed production process conditions.The optimal conditions for L.edodes liquid seed production were achieved and listed as follows：corn flour 36.0 g，wheat bran 21.0 g，brown sugar 20.0 g，beef powder 4.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，VB110.0 mg，H2O 1.0 L，initial pH6.2，inoculation quantity 7.0%，temperature 29℃，agitation speed of rotary shaker 180 r/min，culture time 10 days.Under the optimal conditions，the mycelial biomass of L.edodes was 51.004 g/L，compared to the theoretical value，the relative error of 2.098%.So the response surface method was feasible for the optimization of liquid seed production process of L.edodes，and the predicted values of Mathematical model were consistent with experimental observations.

Lentinus edodes；liquid Seed；response surface；optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0290-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.050

2015－01－04

陳文強（1956-），男，大學本科，教授，研究方向：微生物資源的保護與利用，E-mail：wenqiangc@126.com。

陜西省“13115”科技創新工程計劃項目﹙2008IDGC-04﹚。