冷藏三文魚片特定腐敗菌致腐能力測定與分析

丁　　婷，李婷婷，鄒朝陽，黃作慶，勵建榮，3，*（.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州203；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連6600；3.西南大學食品學院，重慶0075；.大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧大連600）

冷藏三文魚片特定腐敗菌致腐能力測定與分析

丁婷1，李婷婷2，3，*，鄒朝陽1，黃作慶4，勵建榮1，3，*
（1.渤海大學食品科學研究院，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧錦州121013；2.大連民族學院生命科學學院，遼寧大連116600；3.西南大學食品學院，重慶400715；4.大連天寶綠色食品股份有限公司，遼寧大連116001）

以接種三文魚片特定腐敗菌（熒光假單胞菌）的無菌三文魚片和滅菌三文魚汁為研究對象，通過定期測定其在0℃冷藏過程中腐敗菌數、腐敗代謝產物及感官的變化情況，并以其產生腐敗臭味時的TVB-N產量因子（YTVBN/CFU）作為其腐敗能力的定量指標，探究三文魚片特定腐敗菌熒光假單胞菌的致腐能力。結果表明：接種熒光假單胞菌的無菌魚片和滅菌魚汁的貨架期分別為216 h和144 h，此時假單胞菌的菌落數分別為7.54 lg cfu/g和7.03 lg cfu/mL；TVB-N的含量分別為30.82 mg/100 g和29.76 mg/100 mL；產量因子YTVB-N/CFU分別為6.36×10-9mg TVB-N/CFU和0.22× 10-9mg TVB-N/CFU。該研究可為靶向抑制三文魚腐敗優勢菌的生長，提高三文魚的品質及延長其貨架期提供一定的參考。

三文魚，腐敗菌，腐敗代謝物，貨架期，產量因子

三文魚（Salmon）等水產品由于水分含量高、營養物質豐富，加之組織脆弱、不飽和脂肪酸易被氧化等特點，在冷藏過程中極易發生腐敗［1］。而在水產品的腐敗過程中，只有少數細菌參與腐敗代謝過程，這些適合于生存、繁殖并產生腐敗代謝物質的菌群，即為水產品的特定腐敗菌（Specific Spoilage Organism，SSO）［2］。特定腐敗菌在水產品的腐敗過程中起著主導作用，且SSO的變化與水產品的貨架期有著密切的關系。水產品的特定腐敗菌的生長繁殖較其他微生物快，且腐敗能力較強［3］。據報道［4］，有氧冷藏過程中，不同水域的魚、貝類和甲殼類的特定腐敗菌多為腐敗希瓦氏菌（Shewanella）和假單胞菌（Pseudomnas）。特定腐敗菌在水產品中生長代謝過程中生成醛、酮、胺、有機酸等物質，產生腐敗代謝臭味，最終致使水產品感官不可接受，造成其品質的下降。因此腐敗代謝產物的產量因子如三甲胺、TVB-N、組胺或其他與腐敗有關的代謝產物的產量因子都可作為食品腐敗菌的評價指標［5］。

目前對于三文魚片的研究主要集中于理化品質方面，對于其優勢腐敗菌的致腐能力研究相對較少，因此，對冷藏的三文魚片在貯藏過程中優勢腐敗菌致腐能力的測定及分析，可為靶向抑制其SSO的生長，提高三文魚的品質及延長其貨架期提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冰鮮挪威三文魚（從挪威運往大陸需3 d左右）購自錦州林西水產市場；假單胞CFC選擇培養基、營養瓊脂、營養肉湯培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基添加劑北京奧博星生物技術有限責任公司；氧化三甲胺、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸天津市致遠化學試劑有限公司。

PL602-L電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FOSS凱氏定氮儀丹麥福斯公司；冷凍離心機德國Beckman制造公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；VITEK 2 COMPECT全自動微生物鑒定儀生物梅里埃中國有限公司；Nikon DS-Fi1顯微鏡日本尼康公司。

1.2實驗方法

1.2.1預處理三文魚購買后冰藏條件下立即運往實驗室。無菌條件下將三文魚去皮，裝入滅菌的塑料袋中，置于0℃下，備用。

1.2.2熒光假單胞菌菌懸液的制備按參照文獻［6］中的方法進行制備。將從實驗室-80℃保存的達貨賀期終點的三文魚片中分離純化鑒定得到的特定腐敗菌（熒光假單胞菌）活化后，接種到營養瓊脂培養基上劃線培養，25℃培養箱培養24 h后，挑取典型生長的單菌落于300 mL液體培養基，25℃培養12～18 h，菌液濃度達到108cfu/mL，離心后，倒上清液，用滅菌后的生理鹽水將菌稀釋到106cfu/mL，備用。

1.2.3三文魚無菌魚片的制備參照文獻［7］中的方法進行無菌魚片的制備。無菌條件下將去皮的三文魚放在滅菌的砧板上，用75%的酒精擦拭魚體表面，使魚體表面菌落數小于102cfu/mL，再將其切成約5 cm×5 cm×0.3 cm的魚片，備用。

1.2.4三文魚滅菌魚汁的制備參照文獻［8］的方法制備三文魚滅菌魚汁且略有修改。稱取500 g三文魚片絞碎后，加水500 mL，攪拌均勻后煮沸，冷卻后過濾。將濾液4200 r/min離心30 min，取上清液。在上清液中加入0.1 mol/L磷酸緩沖液，調pH為6.6。每升魚汁中加入1.6 g氧化三甲胺、40 mg L-半胱氨酸及40 mg L-甲硫氨酸，混合均勻后于121℃滅菌15 min。

1.2.5接種及貯藏在無菌操作臺內將切好的三文魚片放入菌懸液中浸泡10 s左右，拿出瀝干。裝入滅菌的塑料袋中（約100 g/袋，每袋10塊），封口后置于0℃下貯藏。

無菌操作吸取0.1 mL菌懸液加入200 mL三文魚滅菌魚汁中，每24 h定期取樣對無菌三文魚片及滅菌三文魚汁的揮發性鹽基氮值（TVB-N）和熒光假單胞菌菌落數進行測定。

1.2.6感官評價對三文魚無菌魚片的感官評價標準參考佟懿等［9］感官評價方法。由6名經培訓的評價員組成感官評價小組，評價不同時間三文魚片的氣味、色澤、組織狀態及組織彈性情況，評價標準見表1。6分以上為新鮮度較好。評價結束后，對感官評價結果取平均值。

對于三文魚無菌魚汁只對其氣味進行評價，當三文魚滅菌魚汁產生腐敗臭味時即達到貨架期終點。

1.2.7揮發性鹽基氮的測定參照SC/T 3032-2007中華人民共和國水產行業標準《水產品中揮發性鹽基氮的測定》中的方法進行測定。

1.2.8假單胞菌菌落數的測定按照GB/T4789.2-2010《食品衛生微生物學檢驗：細菌總數測定》中描述的方法進行稀釋平板計數法測定菌落總數。滅菌后的假單胞CFC選擇培養基冷卻到50℃左右后，加入一支假單胞菌CFC選擇性培養基添加劑搖勻后再倒平板。

1.2.9微生物生長動力學分析修正的Gompertz模型［10］對無菌三文魚片和滅菌三文魚汁中的微生物進行動力學分析

表1　0℃冷藏三文魚片的感官評價標準Table 1　Sensory evalution standard of salmon slices stored at 0℃

修正的Gompertz模型表達式為：

式中，t為時間（h）；N（t）為時間t時的菌數；N0、Nmax為初始和最大菌數（cfu/g）；μmax為最大比生長速率（h-1）；λ為生長延滯時間（h）。

1.2.10致腐能力定量分析以揮發性鹽基氮的產量因子（YTVB-N/CFU）作為熒光假單胞菌腐敗能力的定量指標。

式中，YTVB-N/CFU為單位腐敗菌產生的TVB-N值（mg TVB-N/CFU）；N0為初始腐敗菌數（lg cfu/g，lg cfu/ mL）；Ns為貨架期終點時的腐敗菌數（lg cfu/g，lg cfu/ mL）；（TVB-N）0為初始點的TVB-N含量；（TVB-N）s為貨架期終點時的TVB-N含量。

1.3數據分析

用Excel 2003軟件及Orign 8.0軟件進行數據處理、作圖及方差分析，用修正的Gompertz方程對冷藏三文魚無菌魚片及滅菌魚汁在貯藏過程中的假單胞菌菌落變化情況進行非線性擬合。

2　結果與討論

2.1冷藏三文魚無菌魚片及滅菌魚汁熒光假單胞菌變化情況

圖1 無菌三文魚片和滅菌三文魚汁假單胞菌菌落總數變化情況Fig.1　The change of the number of Pseudomonas in sterile salmon fillets and juice

高水分含量及高營養物質含量使魚肉成為易腐爛的產品，即使在冷藏條件下也只能維持較短的時間。而微生物活動是導致儲藏期間魚肉腐敗的最主要原因［11］。水產品中的細菌數量是表示其腐敗程度的一個重要指標［12］。圖1為三文魚無菌魚片與滅菌魚汁的特定腐敗菌菌落總數變化情況。從圖1中可以看出，無菌魚片和滅菌魚汁的腐敗菌生長曲線都為典型的“S”型曲線。無菌魚片和滅菌魚汁的初始菌落數分別為3.63 lg cfu/g和2.67 lg cfu/mL。無菌魚片中假單胞菌的生長延滯期較長，到第100 h左右時到達對數生長期，此時生長迅速，當到達第168 h時進入穩定期，此時菌落數變化趨于穩定。到達第216 h時，無菌三文魚片出現異味，此時假單胞菌的菌落數為7.54 lg cfu/g。滅菌魚汁中的假單胞菌生長延滯期較短，從第50 h左右開始迅速增長，到第100 h時已經超過滅菌魚片中的菌落總數，到第144 h時出現異味，到達貨架期終點，此時假單胞菌的菌落數為7.03 lg cfu/mL，到168 h左右到達穩定期后，細菌菌落總數趨于穩定，到后期則呈現下降趨勢。其下降原因可能是由于在滅菌魚汁中的微生物在儲藏后期營養物質減少且產生的腐敗代謝產物如生物胺、有機酸等物質，限制了細菌的增長。

用修正的Gompertz模型對無菌魚片和滅菌魚汁中的假單胞菌數進行非線性擬合，結果如圖2所示。

圖2　無菌三文魚片和滅菌三文魚汁假單胞菌非線性擬合Fig.2　Nonlinear fitting of Pseudomonas in sterile salmon fillets and juice according time

圖2為無菌三文魚片和滅菌三文魚汁中的假單胞菌用修正的Gompertz非線性擬合后的變化趨勢。從圖2中可以看出，擬合后的曲線為典型的S型曲線。大多數數據點離擬合曲線較近，擬合曲線與菌落變化情況擬合效果較好，說明修正的Gompertz方程能較好的反映無菌三文魚片和滅菌三文魚汁中的假單胞菌隨時間的變化情況。擬合后的參數如表2所示。

表2　三文魚無菌魚片和滅菌魚汁中假單胞菌非線性擬合相關參數Table 2　Nonlinear fitting parameters of Pseudomonas in sterile salmon fillets and juice

從表2中可以看出，假單胞菌非線性擬合后的回歸相關系數較高，R2分別為0.98和0.99。最大比生長速率分別為0.04 h-1和1.82 h-1。生長延滯期為55.54 h和12.45 h。滅菌魚汁中的假單胞菌生長延滯期小于無菌魚片，這可能是因為魚汁為液體培養基，更適合細菌在液體培養基中擴散，而魚片屬于固體培養基，結締組織緊密，假單胞菌在其上生長繁殖需要一定的適應時間。

2.2冷藏三文魚無菌魚片及滅菌魚汁TVB-N變化情況

揮發性鹽基氮是指肉及肉制品的水浸液在堿性條件下能與水蒸汽同時蒸餾出來的總氮量。揮發性鹽基氮的產生是由于動物性食品的蛋白質在酶和微生物的作用下，產生氨及胺類等堿性含氮物質所導致。目前已成為我國和世界上多個國家用來鑒定水產品腐敗程度的一個重要指標［13］。圖3為三文魚無菌魚片和滅菌魚汁在貯藏過程中TVB-N的變化情況。從圖3中可以看出，三文魚無菌魚片和滅菌魚汁中TVB-N值隨貯藏時間的延長呈現增加的趨勢。三文魚無菌魚片和滅菌魚汁中TVB-N的初始值分別為8.573 mg/100 g和6.624 mg/100 mL。三文魚無菌魚片中的TVB-N值在初始階段增加較為緩慢，到第100 h時增長速度加快，到第216 h時達到30.82 mg/100 g，接近《GB 2707-2005鮮、凍動物性水產品衛生標準》中對于海水魚中揮發性鹽基氮的含量應小于30 mg/100 g的規定，因此，無菌三文魚片的貨架期約為216 h。三文魚滅菌魚汁中的TVB-N值在前50 h增加較為緩慢，到50 h后開始迅速增加，到第144 h時達到29.76 mg/100 g，接近貨架期終點。TVB-N的增長情況與假單胞菌的生長情況相一致。

圖3　無菌三文魚片和滅菌三文魚汁TVB-N變化情況Fig.3　The change of TVB-N in sterile salmon fillets and juice

2.3冷藏三文魚無菌魚片及滅菌魚汁感官評價變化情況

某些微生物降解游離氨基酸產生胺、硫化物、有機酸、醛類、酮類、脂類物質等腐敗異味，使得水產品達到感官不可接受狀態。圖4為接種熒光假單胞菌的無菌三文魚片和滅菌三文魚汁的感官評價的變化情況。圖4表明，隨著儲藏時間的延長，三文魚無菌魚片和滅菌魚汁的感官評分逐漸降低。無菌三文魚片和滅菌三文魚汁在第216 h和第144 h時開始出現異味，此時的感官評分分別為24.68和24.10，達到腐敗點，即貨架期終點。隨后無菌魚片和滅菌魚汁開始出現強烈的腐敗臭味，且魚片出現變色且有渾濁汁液流出的現象。

圖4　無菌三文魚片和滅菌三文魚汁感官評分變化情況Fig.4　The change of sensory evaluation in sterile salmon fillets and juice

表3　接種熒光假單胞菌的無菌三文魚片和滅菌三文魚汁初始點及腐敗點的菌落總數、TVB-N值及產量因子Table 3　The number of colonies and TVB-N value and yield factors on the initial points and spoilage points in sterile salmon fillets and juice inoculated with Pseudomonas fluorescent

2.4三文魚特定腐敗菌致腐能力分析

表3為接種熒光假單胞菌的無菌三文魚片和滅菌三文魚汁在儲藏過程中初始點及腐敗點的菌落總數及TVB-N值。由公式（2）可得無菌三文魚片和滅菌三文魚汁的TVB-N的產量因子（YTVB-N/CFU）。

從表3中可以看出，無菌三文魚片中熒光假單胞菌的產量因子為6.36×10-9mg TVB-N/CFU，說明熒光假單胞菌有較強的腐敗能力，這與許振偉等［14］對冷藏鯉魚和羅非魚的優勢腐敗菌腐敗能力分析所得結論一致。滅菌三文魚汁的產量因子YTVB-N/CFU為0.22×10-9mg TVBN/CFU，小于無菌三文魚片的產量因子，這可能是因為制備三文魚滅菌魚汁時需進行煮沸、過濾等操作，致使一部分含氮化合物損失，從而導致其產量因子偏小。

3　結論

通過測定接種特定腐敗菌（熒光假單胞菌）的無菌三文魚片和滅菌三文魚汁在0℃冷藏過程中腐敗菌、腐敗代謝產物及感官的變化情況，并用修正的Gompertz方程對腐敗菌的生長進行動力學分析，并以其產生腐敗臭味時的TVB-N的產量因子（YTVB-N/CFU）作為腐敗能力的定量指標，表明：接種熒光假單胞菌的無菌魚片和滅菌魚汁的貨架期分別為216 h和144 h，產量因子YTVB-N/CFU為6.36×10-9mg TVB-N/CFU和0.22× 10-9mg TVB-N/CFU。該研究可為靶向抑制三文魚腐敗優勢菌的生長，提高三文魚的品質及延長其貨架期提供一定的參考。

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Measurement and analysis of spoilage ability of specific spoilage organism in refrigerated salmon fillets using different methods

DING Ting1，LI Ting-ting2，3，*，ZOU Zhao-yang1，HUANG Zuo-qing4，LI Jian-rong1，3，*
（1.Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，Jinzhou 121013，China；2.College of Life Science，Dalian Nationality of University，Dalian 116600，China；3.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China；4.Dalian Tianbao Green Food Co.，Ltd.，Dalian 116001，China）

The sterile salmon fillets and juice which were inoculated with specific spoilage organism（Pseudomonas fluorescent）were taken as the research objects，and the number of spoilage bacteria，spoilage metabolites and the change of sensory evaluation were measured during the cold storage of 0℃.The yield factor（YTVBN/CFU）for production of TVB-N was used as the quantitative index of spoilage ability when fish produced putrid odour，in order to measure the spoilage ability of specific spoilage organism of salmon fillets.The results showed that the shelf-life of sterile salmon fillets and juice inoculated with Pseudomonas fluorescent were 216 h and 144 h，and at that period，the numbers of Pseudomonas fluorescent were 7.54 lg cfu/g and 7.03 lg cfu/mL，respectively.The contents of TVB-N were 30.82 mg/100 g and 29.76 mg/100 mL，separately，and the yield factors of TVB-N were 6.36×10-9mg TVB-N/CFU and 0.216×10-9mg TVB-N/CFU.The research provided some

on the targeted inhibition of specific spoilage organism，improving the quality and extending the shelf-life of salmons.

salmon；spoilage bacteria；metabolites；shelf-life；yield factor

TS254.9

A

1002-0306（2015）18-0315-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.055

2015－01－04

丁婷（1991-），女，碩士研究生，主要從事水產品貯藏加工及質量安全控制方面的研究，E-mail：dingting0532@163.com。

李婷婷（1978-），博士，副教授，主要從事水產品貯藏加工及質量安全控制方面的研究，E-mail：tingting780612@163.com。勵建榮（1964-），男，博士，教授，主要從事水產品和果蔬貯藏加工及質量安全控制方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

國家自然科學基金（31301572，31471639）；中國博士后科學基金（2014M552302）；“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAD29B06）；重慶市項目博士后資助（Xm2014041）。