雙酶法制備沙丁魚ACE抑制肽的工藝研究

黃嘉成，彭喜春（暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東廣州510632）

雙酶法制備沙丁魚ACE抑制肽的工藝研究

黃嘉成，彭喜春*
（暨南大學理工學院食品科學與工程系，廣東廣州510632）

本實驗以廣東大宗低值沙丁魚為原料，采用不同蛋白酶降解沙丁魚以篩選合適的酶組合，然后對原料的酶解制備血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽的工藝進行研究。結果表明，制備沙丁魚ACE抑制肽的酶組合為：木瓜蛋白酶與堿性蛋白酶；酶解的最佳工藝參數為：第一步采用木瓜蛋白酶進行酶解，酶解溫度70℃、pH7.5、反應時間2.25 h、酶添加量4000 U/g、料液比30%（w/v）；采用堿性蛋白酶進行第二步酶解，酶解溫度70℃、pH10.0、反應時間2.0 h、酶添加量5000 U/g。通過工藝優化，沙丁魚蛋白質的水解度提高到28.44%，并且最終水解蛋白肽的ACE抑制率為73.44%。

沙丁魚，雙酶法，ACE抑制肽，酶解條件

高血壓被稱為“無聲殺手”，在早期沒有明顯癥狀，直到發生臨床危象，如心臟病發作、腦血管破裂等。在我國，高血壓的發病率已達到18.8%，而全世界每年死于高血壓的人數高于其他任何一種疾病，由高血壓引發的心腦血管疾病的死亡率已排到所有疾病死亡率的第一位［1］。目前用于高血壓治療的藥物主要有血管緊張素轉化酶抑制劑如卡托普利、福辛普利、依那普利等，雖然療效非常明顯，但其對腎臟的毒副作用以及服藥后出現的低血壓、干咳等癥狀，使人們對其安全性產生憂慮［2］。來源于食物的ACE抑制肽，其食用安全性高、副作用小，突出優點是只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者無降壓作用，不會有降壓過度的現象發生［1］，因此食物源ACE抑制肽成為了研究熱點。據報道，已經有研究人員從酪蛋白［3］、海蜇［4］、豆類［5］、大米［6］等食物中制備得到ACE抑制肽。

沙丁魚（Sardina melamosticta），又稱薩丁魚、鳁和鰯。我國東南沿海有豐富的沙丁魚類資源，其基本成分如下：水分含量81.72%、干基蛋白質含量84.79%、干基脂肪4.02%、干基灰分4.75%［7］。沙丁魚屬于近海小型中上層魚類，它具有生長快、繁殖力強的優點，在漁獲物中出現頻率高［8］。因此，沙丁魚作為一種豐富的動物蛋白質資源，具有很大的開發前景。有文獻報道，通過模擬人體胃腸道消化系統，發現源于魚蛋白的多肽類物質是一種新型的營養價值豐富的生物活性肽［9］。其生物活性主要表現在：降血壓、抗氧化、抗菌、抗凝血和降膽固醇等［10-11］。

近年來，已有國內外研究人員從明太魚、金槍魚、海鯛、黃碟魚、鰹魚等魚蛋白中制備出了血管緊張素轉化酶（Angiotensin converting enzyme，簡稱ACE）抑制肽［10-12］。日本學者Matsui采用了單一的堿性蛋白酶對沙丁魚肌肉進行酶解，發現酶解產物對ACE具有較強的抑制作用［13］。基于日本學者Matsui的研究，在本研究中，以廣東大宗低值沙丁魚為原料，使用了2～3種不同的蛋白酶并結合分步酶解的方法，制備沙丁魚ACE抑制肽，同時對分步酶解的工藝進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

沙丁魚廣東省陽江市大開水產有限公司提供；菠蘿蛋白酶（酶活力為6×105U/g） 廣州市齊云生物技術有限公司；中性蛋白酶（酶活力為6×104U/g） 廣州市齊云生物技術有限公司；胰蛋白酶（酶活力為2.5×105U/g）廣州市齊云生物技術有限公司；酸性蛋白酶（酶活力為5×104U/g） 廣州市齊云生物技術有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為5.81×104U/g）廣州市華琪生物科技有限公司；Protex6L堿性蛋白酶（酶活力為5.13×105U/g） 廣州柏棠貿易有限公司；血管緊張素轉化酶（ACE） Sigma公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，簡稱HHL）Sigma公司；其他試劑均為分析純。

HR1844-PHILIPS高速組織攪碎機器珠海市飛利浦家庭電器有限公司；PL602-S電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HH-4恒溫水浴鍋江蘇金壇市宏華儀器廠；GT16-3北利高速離心機北京時代北利離心機有限公司；PHS-3C pH計上海精密儀器有限公司；JB50-D增力攪拌機上海標本模型廠；RE-52旋轉蒸發器上海嘉鵬科技有限公司；ULT1386-3-V37超低溫冰箱賽默飛世爾公司；FD-1冷凍干燥機北京博醫康實驗儀器有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司；UV-1801紫外分光光度計北京北分瑞利分析儀器有限責任公司。

1.2實驗方法

1.2.1篩選水解沙丁魚蛋白肽的酶組合沙丁魚的預處理：將沙丁魚清洗干凈后去頭去鱗，放入高速組織攪碎機里攪成肉末狀，并在37℃的恒溫水浴中自溶3 h。然后，將沙丁魚肉末以30%（W/V）的濃度加入蒸餾水中并攪拌均勻，采用不同的酶組合對沙丁魚進行分步酶解。分兩步酶解的組合有：菠蘿蛋白酶→堿性蛋白酶，中性蛋白酶→堿性蛋白酶，胰蛋白酶→堿性蛋白酶，酸性蛋白酶→堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶→堿性蛋白酶，并按如上順序分步添加各蛋白酶。分三步酶解的組合有：木瓜蛋白酶→菠蘿蛋白酶→堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶→中性蛋白酶→堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶→胰蛋白酶→堿性蛋白酶，并按如上順序分步添加各蛋白酶。酶解時間如下：非堿性蛋白酶的酶解時間均為1.5 h，堿性蛋白酶的酶解時間為2 h。不同酶的反應條件如表1所示。

表1　不同蛋白酶的酶解條件Table 1　Enzymatic conditions of different proteases

酶解完成后，將酶解液至于恒溫水浴中95℃滅酶15 min，冷卻后10000 r/min離心20 min，取上清液置于旋轉蒸發儀中旋蒸，然后冷凍干燥，得到沙丁魚ACE抑制肽的粗制品，分別檢測不同酶解液凍干粉的ACE抑制活性，篩選出最佳的酶組合。

1.2.2酶解條件的優化以上述分步酶解工藝為基礎，以水解度DH值為指標，對酶組合中各酶的反應溫度、pH、反應時間、酶添加量、料液比五個反應條件進行單因素實驗，確定各反應條件的較佳范圍。

1.2.2.1木瓜蛋白酶酶解條件優化第一步酶解使用的是木瓜蛋白酶。

設置反應的溫度為：55、60、65、70、75℃，在pH7.0、酶添加量1200 U/g、1.5 h、料液比30%（W/V）的條件下進行酶解，考察溫度對DH值的影響；

設置反應的pH為：6.6、6.9、7.2、7.5、7.8，在溫度65℃、酶添加量1200 U/g、1.5 h、料液比30%（W/V）的條件下進行酶解，考察pH對DH值的影響；

設置反應的時間為：1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 h，在溫度65℃、pH7.2、酶添加量1200 U/g、料液比30%（W/V）的條件下進行酶解，考察時間與DH值之間的關系；

設置反應的酶添加量為：1000、2000、3000、4000、5000 U/g，在溫度65℃、pH7.2、反應時間2.0 h、料液比30%（W/V）的條件下進行酶解，考察酶添加量與DH值之間的關系；

設置反應的料液比為：20%、25%、30%、35%、40%（W/V），在溫度65℃、pH7.2、反應時間2.0 h、酶添加量3000 U/g的條件下進行酶解，考察料液比與DH值之間的關系。

再設計4因素3水平的正交實驗（如表2所示），確定出木瓜蛋白酶的最終反應條件。

表2　木瓜蛋白酶正交實驗因素水平表Table 2　Factors and levels of orthogonal design for Papain

1.2.2.2堿性蛋白酶酶解條件優化以經木瓜蛋白酶酶解后的沙丁魚酶解液做為底物，第二步使用堿性蛋白酶進行酶解。

設置反應的溫度為：50、55、60、65、70℃，在pH9.0、酶添加量1700 U/g、2.0 h的條件下進行酶解，考察溫度對DH值的影響；

設置反應的pH為：8.5、9.0、9.5、10、10.5，在溫度65℃、酶添加量1700 U/g、2.0 h的條件下進行酶解，考察pH對DH值的影響；

設置反應的時間為：1.5、1.75、2.0、2.25、2.5 h，在溫度65℃、pH9.5、酶添加量1700 U/g的條件下進行酶解，考察時間與DH值之間的關系；

設置反應的酶添加量為：1000、2000、3000、4000、5000 U/g，在溫度65℃、pH9.5、反應時間2.0 h的條件下，考察酶添加量與DH值之間的關系。

再設計4因素3水平的正交實驗（如表3所示），確定出堿性蛋白酶的最終反應條件，并驗證其最終水解度和ACE抑制率。

表3　堿性蛋白酶正交實驗因素水平表Table 3　Factors and levels of orthogonal design for Alcalase

1.2.3水解度的測定采用甲醛滴定法測定水解度，參考文獻［14］。

1.2.4酶活力的測定根據GB/T 23527-2009，采用福林法測定酶活力。

1.2.5ACE抑制率的測定［15］取經冷凍干燥后的沙丁魚蛋白肽固體粉末0.2 g溶于10 mL蒸餾水中，離心（10000 r/min，15 min）；依次加入離心后的上清液60 μL，10 mmol/L的HHL溶液80 μL（用pH8.3的磷酸鹽緩沖溶液配制而成），25 mU/mL的ACE溶液10 μL，置于37℃的恒溫水浴中反應80 min；加入110 μL的1 mol/L的HCl，終止反應；然后加入1.5 mL的乙酸乙酯進行萃取，混合均勻后離心（10000 r/min，15 min）；吸取乙酸乙酯層1 mL，置于烘箱中揮發溶劑（90℃，10 min）；用3 mL的蒸餾水溶解烘干后的物質，于228 nm下測定吸光度。ACE抑制率的計算公式如下：

其中，ODA為僅存在ACE和HHL時溶液的吸光度值；ODB為存在ACE、ACE抑制肽和HHL時溶液的吸光度值；ODC為僅存在HHL時溶液的吸光度值。

1.2.6數據處理與分析所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準差的形式表示。實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行處理與統計分析。

2　結果與分析

2.1篩選水解沙丁魚肽的酶組合

不同的蛋白酶，其酶切位點各不相同。因此，采用不同的蛋白酶組合對沙丁魚進行酶解，制備得到的沙丁魚ACE抑制肽結構及其ACE抑制活性也有所不同。本實驗以ACE抑制率為指標，篩選出最適宜的酶解組合。

經不同酶組合酶解制得的沙丁魚ACE抑制肽的抑制率結果如表4所示。由“木瓜蛋白酶+堿性蛋白酶”酶解制得的沙丁魚肽的ACE抑制率最高，達到65.40%，且顯著高于其他酶組合（p＜0.05），同時其水解度也達到了較高的水平為16.70%。雖然由“胰蛋白酶+堿性蛋白酶”酶解制得的沙丁魚肽的水解度最高，達到18.13%，但其ACE抑制率僅為54.10%。可能是因為胰蛋白酶容易將一些ACE抑制活性較強的肽段切斷，雖然水解度更高，但是產物的ACE抑制率反而下降。因此，后面的實驗選用“木瓜蛋白酶+堿性蛋白酶”這一組合的酶解工藝進行優化。

表4　不同酶組合制得的沙丁魚蛋白肽的水解度與ACE抑制率結果Table 4　Degree of hydrolysis and AC-inhibitory rate of sardine peptides by different proteases

有文獻指出，水解度與ACE抑制活性存在一定的正相關關系，即在一定范圍內，水解度的升高，有利于ACE抑制活性的增強［16］。從相對分子質量大小上看，目前發現的多數ACE抑制肽是由3～9個氨基酸殘基組成的短肽，降壓效果較好的乳源蛋白肽則多為含6～10個氨基酸殘基的寡肽，也有極個別的由27個氨基酸組成［11］。所以，以此為基礎優化雙酶酶解的反應條件，提高沙丁魚蛋白的水解度，以制備抑制活性更高的沙丁魚ACE抑制肽。

2.2木瓜蛋白酶的單因素實驗

2.2.1溫度對DH值的影響結果見圖1，當溫度低于65℃時，DH值隨著反應溫度的升高而增大；當溫度上升至65℃時，DH值達到最大值；當溫度超過65℃時，DH值隨著反應溫度的升高而減小。溫度的高低直接影響到酶的活性，從而影響了木瓜蛋白酶水解沙丁魚蛋白的能力。因此，木瓜蛋白酶的最適溫度在65℃。

圖1　反應溫度對DH值的影響Fig.1　Relationship between DH and temperature

2.2.2pH對DH值的影響結果見圖2，當pH小于7.2時，DH值隨著反應pH的升高而增大；當pH上升至7.2時，DH值達到最大值；當pH超過7.2時，DH值隨著pH的升高而減小。同樣，pH的高低也直接影響到酶的活性，從而影響了木瓜蛋白酶水解沙丁魚蛋白的能力。因此，木瓜蛋白酶的最適pH在7.2。

圖2　反應pH對DH值的影響Fig.2　Relationship between DH and pH

2.2.3時間對DH值的影響結果見圖3，反應時間在1.0～1.5 h內，DH值隨著酶解時間的延長而增大，其上升的幅度較大；反應時間在1.5～2.0 h內，DH值依舊隨著酶解時間的延長而增大，但其上升的幅度已有所下降。顯然，隨著酶解時間的延長，DH值不斷增大。但由于可被其水解的肽鍵數也隨著時間的延長而減少；過長的酶解時間也使得生產效率降低、成本增加。因此，初定木瓜蛋白酶的酶解時間在2.0 h。

圖3　反應時間對DH值的影響Fig.3　Relationship between DH and reaction time

2.2.4酶添加量對DH值的影響結果見圖4，隨著酶添加量的增加，DH值不斷增大。在酶添加量為1000～3000 U/g的范圍內，DH值的上升幅度較大；而在3000～5000 U/g的范圍內，DH值雖然繼續上升，但上升的幅度已明顯減小。若添加了過量的酶，酶與底物已經飽和，部分的酶則難以很好的發揮酶解作用，DH值上升不明顯，并且過多的酶用量也增加了生產成本。因此，初定木瓜蛋白酶的添加量為3000 U/g。

2.2.5料液比對DH值的影響結果見圖5，在料液比為20%～30%（W/V）的范圍內，DH值隨著料液比的增大而增大；而在30%～40%（W/V）的范圍內，DH值隨著料液比的增大而減小。料液比過低時，能被酶水解的蛋白較少，得到的沙丁魚蛋白肽產品較少，加入的酶也難以得到充分利用；料液比過高時，會導致反應溶液體系的粘度增大，限制了酶的催化反應效率，增加了生產成本。因此，初定料液比為30%（W/V）。

圖4　酶添加量對DH值的影響Fig.4　Relationship between DH and the amount of proteases

圖5　料液比對DH值的影響Fig.5　Relationship between DH and substrate concentration

2.3木瓜蛋白酶的正交實驗

對于溫度、pH、反應時間和酶添加量4個因素，分別對其3個水平進行正交實驗。正交實驗結果如表5所示，方差分析結果如表6所示。綜合極差分析結果和方差分析結果可知，在第一步酶解中，影響沙丁魚蛋白DH值的4個因素的主次順序為：B＞A＞D＞C，即pH對DH值的影響最大，其次是溫度，而酶添加量和反應時間對DH值的影響相對較小。以DH值為指標，可以確定出木瓜蛋白酶的最佳酶解工藝為A3B3C3D3，即酶解溫度70℃、pH7.5、酶解時間2.25 h、酶添加量4000 U/g，此時沙丁魚蛋白的水解度為14.96%。

表5　木瓜蛋白酶正交實驗結果表Table 5　Results of orthogonal design for Papain

表6　木瓜蛋白酶正交實驗方差分析Table 6　Variance analysis of the orthogonal design for Papain

2.4堿性蛋白酶的單因素實驗

2.4.1溫度對DH值的影響結果見圖6，當溫度低于65℃時，DH值隨著反應溫度的升高而增大；當溫度上升至65℃時，DH值達到最大值；當溫度超過65℃時，DH值隨著反應溫度的升高而減小。原因同樣在于溫度的高低影響了酶的活性。因此，堿性蛋白酶的最適溫度在65℃。

圖6　反應溫度對DH值的影響Fig.6　Relationship between DH and temperature

2.4.2pH對DH值的影響結果見圖7，當pH小于9.5時，DH值隨著反應pH的升高而增大；當pH上升至9.5時，DH值達到最大值；當pH超過9.5時，DH值隨著pH的升高而減小。同樣的，過低或過高的pH不利于堿性蛋白酶發揮其水解能力。因此，堿性蛋白酶的最適pH在9.5。

圖7　反應pH對DH值的影響Fig.7　Relationship between DH and pH

2.4.3時間對DH值的影響結果見圖8，在1.5～2.0 h內，DH值隨著酶解時間的延長而增大，其上升的幅度較大；在2.0～2.5 h內，DH值依舊隨著酶解時間的延長而增大，但其上升的幅度已有所下降。酶解時間的延長，必然伴隨著DH值的增大。同樣考慮到酶活的持久性、酶的專一性、生產效率與成本，初定堿性蛋白酶的酶解時間在2.0 h。

圖8　反應時間對DH值的影響Fig.8　Relationship between DH and reaction time

2.4.4酶添加量對DH值的影響結果見圖9，DH值隨著酶添加量的增加而增大。在酶添加量為1000～3000 U/g的范圍內，DH值的上升幅度較大；在3000～4000 U/g的區間內，DH值雖然繼續上升，但上升的幅度已有所減小；而在4000～5000 U/g的區間內，DH值僅有微弱的變化。考慮到酶與底物的飽和現象、產品的ACE抑制活性與生產成本，初定堿性蛋白酶的添加量為4000 U/g左右。

圖9　反應時間對DH值的影響Fig.9　Relationship between DH and the amount of proteases

2.5堿性蛋白酶的正交實驗

對溫度、pH、反應時間和酶添加量4個因素，進行3個水平的正交實驗。正交實驗結果如表7所示，方差分析結果如表8所示。綜合極差分析結果和方差分析結果可知，在第二步酶解中，影響沙丁魚蛋白DH值的4個因素的主次順序為：B＞D＞A＞C，即pH對DH值的影響最大，其次是酶添加量，而溫度和反應時間對DH值的影響相對較小。以DH值為指標，可以確定出堿性蛋白酶的最佳酶解工藝為A3B3C2D3，即酶解溫度70℃、pH10.0、反應時間2.0 h、酶的添加量5000 U/g，此時沙丁魚蛋白的水解度為28.44%。

表7　堿性蛋白酶正交實驗結果表Table 7　Results of orthogonal design for Alcalase

表8　堿性蛋白酶正交實驗方差分析Table 8　Variance analysis of the orthogonal design for Alcalase

2.6水解度和ACE抑制率驗證

通過單因素實驗和正交實驗，確定出了雙酶法制備沙丁魚ACE抑制肽的最佳工藝。沙丁魚蛋白肽的DH值和ACE抑制率結果如圖10所示。工藝優化前，沙丁魚蛋白肽的DH值為16.70%，ACE抑制率為65.40%；工藝優化后，沙丁魚蛋白肽的DH值提高到28.44%，同時ACE抑制率提高到73.44%。

有文獻報道，在一定范圍內，DH值的提高有利于ACE抑制活性的增強［16］。本實驗的結果與前述報道一致。

圖10　工藝優化前后沙丁魚肽的ACE抑制率對比Fig.10　Comparison of ACE-inhibitory rate of sardine peptides between previous process and optimized process

3　結論

由于單酶法會受到酶專一性的限制，一種蛋白酶只能水解由特定氨基酸組成的肽鍵，使得原料蛋白的水解度偏低，產物的生物活性也易受影響。因此，本文利用不同的酶組合對沙丁魚進行酶解，以ACE抑制率為指標，篩選出最適宜的酶組合為：木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶。通過單因素實驗和正交實驗，并以DH為指標，優化了雙酶分步酶解的反應條件，得到了雙酶法制備沙丁魚ACE抑制肽的最佳工藝。第一步酶解使用的是木瓜蛋白酶，最佳反應條件是：溫度70℃、pH7.5、反應時間2.25 h、酶添加量4000 U/g、料液比30%（w/v）；第二步酶解使用的是堿性蛋白酶，最佳反應條件是：溫度70℃、pH10.0、反應時間2.0 h、酶添加量5000 U/g。經優化后，沙丁魚蛋白的DH值從16.70%提高到了28.44%，其ACE抑制率則從65.40%提高到了73.44%。

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Two-step enzymatic hydrolysis for preparation of ACE-inhibitory peptides from sardine

HUANG Jia-cheng，PENG Xi-chun*
（Department of Food Science and Engineering，College of Science and Engineering，Ji’nan University，Guangzhou 510632，China）

In this experiment，different kinds of proteases were screened to prepare Angiotensin converting enzyme（ACE）inhibitory peptides from Sardine（Sardina melamosticta），and the process of preparing ACE-inhibitory peptides was optimized.The results showed that the combination of papain and Alcalase were the optimal enzymes for preparing ACE-inhibitory peptides from sardine.The optimal conditions of enzymatic hydrolysis were：30%（W/V）of sardine in water was hydrolyzed with 4000 U papain per gram of sardine at 70℃ and pH7.5 for 2.25 h，in the first enzymatic step and then with 5000 U Alcalase per gram of Sardine at 70℃and pH10.0 for 2.0 h in the second enzymatic step.After optimization，the degree of hydrolysis was up to 28.44%and the ACE-inhibitory rate of the final products was 73.44%.

sardine；two-step enzymatic hydrolysis；ACE-inhibitory peptides；enzymatic hydrolysis conditions

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0295-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.051

2015－01－20

黃嘉成（1991-），男，碩士研究生，研究方向：食物功能組分與腸道健康，E-mail：419234306@qq.com。

彭喜春（1976-），男，博士，教授，研究方向：食物功能組分與腸道健康，E-mail：tpxchun@jnu.edu.cn。