信陽毛尖茶色素的超聲提取及其抗氧化活性

李　斌，武曉雪，孟瑤瑤，王麗波（南陽理工學院，生物與化學工程學院，河南南陽473004）

信陽毛尖茶色素的超聲提取及其抗氧化活性

李斌，武曉雪，孟瑤瑤，王麗波
（南陽理工學院，生物與化學工程學院，河南南陽473004）

目的：優化信陽毛尖茶色素的超聲提取工藝及研究其抗氧化活性。方法：在單因素實驗的基礎上采用正交實驗法，考察了料液比、超聲溫度、超聲時間和提取次數對得率的影響；通過二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、超氧自由基以及羥自由基的清除實驗評價信陽毛尖茶色素的抗氧化活性。結果：所考察因素中，對信陽毛尖茶色素得率的影響程度是料液比＞提取次數＞超聲溫度＞超聲時間。超聲提取的最佳條件是料液比1∶30、超聲溫度80℃、超聲時間120 min、提取次數3次，該條件下茶色素得率達到了33.1%。信陽毛尖茶色素具有清除體外自由基的活性，其活性在一定濃度范圍內隨著濃度的增大而增強，對羥基自由基清除活性尤為明顯。結論：采用正交實驗優化提取條件，明顯提高了信陽毛尖茶色素的得率；信陽毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可作為天然抗氧化劑進一步開發和利用。

信陽毛尖，茶色素，提取，抗氧化活性

色素是現代食品工業中不可缺少的食品添加劑之一。人工合成的食用色素化學性質穩定，色澤鮮艷，著色力強，價格低廉，被廣泛應用在食品行業中。但是它們本身沒有任何營養價值，有的具有慢性毒性，甚至有致癌性，所以人們開始尋找新的天然色素資源［1］。茶葉作為我國消費的主流健康飲料，開始受到世界各國人們的青睞?，F代科學研究揭示，茶葉中含有豐富的生物活性物質，它們具有抗氧化［2-3］、清除自由基［4］、抗突變［5］、抗骨質疏松［6］、抗衰老［7-8］、抗癌［5］、抗心血管疾病［9-10］等藥理功效。因此，開展茶葉深加工成為世界茶葉加工的趨勢所在。我國盛產茶葉，每年從茶園到加工成茶葉產品的一系列生產環節中產生的茶葉副產品數量相當大，將這些副產品及低檔茶用于茶葉功能成分的提取，不僅可以合理開發利用自然資源，提高茶葉本身的經濟價值，還可以獲得一系列茶色素，拓寬色素市場，滿足人們日益增長的對天然色素的需求。

信陽毛尖屬未發酵的綠茶，產于河南省信陽市的8個縣、區，是我國十大名茶之一。其品質優異，外形條索細、圓、緊、直，色澤翠綠，內質湯色碧綠明亮，香氣高鮮，滋味鮮濃、爽口，葉底嫩綠且勻整［11］。目前，人們對于信陽毛尖茶多酚［12］、茶多糖［13］、咖啡因［14］等的提取工藝研究都已有報道，但是還未見有人從事茶色素方面的研究。本實驗對信陽毛尖茶色素提取進行了單因素分析，并進一步對提取條件進行了正交優化，同時研究了信陽毛尖茶色素的抗氧化作用，旨在為深入研究信陽毛尖茶色素提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

信陽毛尖信陽市浉河區天潭茶葉有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）、還原性輔酶I（NADH）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、抗壞血酸（VC） 美國Sigma公司；95%乙醇、1，10-菲咯啉、過氧化氫（H2O2）天津市致遠化學試劑有限公司；氯仿天津市華東試劑廠；NaOH天津市化學試劑六廠三分廠；HCl開封開化有限公司試劑廠，以上試劑均為分析純。

U-1800紫外-可見分光光度計日本Hitachi公司；UP3200H超聲波清洗器熊貓集團南京電子計量有限公司；JA1003型電子天平上海良平器儀器表有限公司；101-2A型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；85-1型離心機 上海安亭科學儀器廠；RE-2010型旋轉蒸發儀鞏義市華予華儀器有限公司；PHS-3C型數顯pH計上海雷磁儀器廠；XH-KG66型水平恒溫振蕩器廣東佛山市航星自動化設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程本工藝流程參考陳麗如等［15］提出的方法。將茶葉用研缽研磨粉碎，過40目篩，備用。稱取一定量茶葉粉末裝于250 mL錐形瓶中，按照一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度下超聲提取，提取完畢后將提取物于5000 r/min離心20 min，取上清液得到茶色素粗溶液。將濾液在50℃減壓濃縮至15 mL，加入45 mL 95%乙醇沉淀除去多糖、蛋白質等雜質，并用1 mol/L的HCl調節溶液pH為3.2，靜置30 min，5000 r/min離心20 min，取上清液抽濾得濾液。將濾液加入200 g/L NaOH調節pH為7.5，抽濾得濾液。將濾液50℃旋轉蒸發至干，60℃真空干燥。所得結晶用氯仿萃取除去生物堿和葉綠素，60℃真空，得精制的茶色素。

1.2.2單因素實驗

1.2.2.1料液比對茶色素得率的影響茶色素提取溫度60℃下振蕩60 min，以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（mL/g）料液比對茶色素得率做單因素實驗。

1.2.2.2超聲時間對茶色素得率的影響茶色素提取的料液比為1∶30，溫度60℃，以30、60、90、120、150 min超聲時間對茶色素得率做單因素實驗。

1.2.2.3超聲溫度對茶色素得率的影響固定茶色素提取的料液比為1∶30，超聲60 min，以超聲溫度30、45、60、75、90、105、120℃對茶色素得率做單因素實驗。

1.2.2.4提取次數對茶色素得率的影響茶色素提取的料液比為1∶30，溫度60℃，超聲60 min，按照工藝流程分別提取1、2、3次。

1.2.3正交實驗根據單因素實驗結果，以影響茶色素得率的料液比、超聲溫度、超聲時間和提取次數為因素，各取3個水平進行正交實驗。采用L9（34）正交表進行正交實驗（正交實驗的因素和水平見表1），并以茶色素得率作為評價指標，計算得到最優工藝條件，并在該條件下重復3次實驗。

表1　正交實驗的因素與水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal test

1.2.4DPPH自由基清除活性的測定DPPH清除活性的測定參照Duan等［16］的方法并稍做修改。取100 μL不同濃度的信陽毛尖茶色素（20～100 μg/mL），加入2900 μL的120 μmol/L DPPH溶液，混合物在避光條件下37℃反應30 min后，分光光度計測定517 nm處的吸光度值；同時，使用VC作為陽性對照按上述方法測定DPPH清除活性。DPPH的清除活性主要采用下面的公式進行計算：

其中，Ablank是對照實驗的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實驗的吸光度值。

1.2.5超氧自由基清除活性的測定超氧自由基清除活性的測定參照Liu等［17］的方法并稍做修改。取1 mL不同濃度的信陽毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入由0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）配制的156 μmol/L的NADH，52 μmol/L的NBT和20 μmol/L的PMS溶液各1 mL，混合物在25℃反應5 min后，分光光度計測定560 nm處的吸光度值；同時，使用VC作為陽性對照按上述方法測定超氧自由基清除活性。超氧自由基的清除活性主要采用下面的公式進行計算：

其中，Ablank是對照實驗的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實驗的吸光度值。

1.2.6羥基自由基清除活性的測定羥基自由基清除活性的測定參照Jin等［18］的方法并稍做修改。取1 mL不同濃度的信陽毛尖茶色素（20～100 μg/mL），先后加入1 mL的1，10-菲咯啉、1.5 mL的0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、1 mL的0.75 mmol/L的FeSO4和1 mL的H2O2溶液（0.01%，v/v），混合物在37℃反應30 min后，分光光度計測定536 nm處的吸光度值；同時，使用VC作為陽性對照按上述方法測定羥基自由基清除活性。羥基自由基的清除活性主要采用下面的公式進行計算：

其中，Ablank是對照實驗的吸光度值（即以水代替樣品），Asample是樣品實驗的吸光度值，A0是以水替代反應體系中的H2O2和樣品的吸光度值。

1.2.7數據分析所有實驗重復3次，結果以±SD表示，數據分析采用SAS 9.2軟件。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1料液比對茶色素得率的影響料液比是影響茶色素得率的重要因素之一，料液比對茶色素得率的影響如圖1所示。由圖1可以看出，隨著溶液量的增加，茶色素的得率先增大后減少，當料液比為1∶40時達到最大值。這是由于茶葉需要吸收較多的水分才能充分溶脹，從而有利于色素的溶出；當料液比達到1∶40時，色素充分溶出，但是繼續增加溶液量后，其他成分過多溶出反而不利于色素的提取。考慮到降低后續工序濃縮的能耗以及提高效率，料液比應該控制在1∶40以內。

圖1　不同料液比對茶色素得率的影響Fig.1　Effect of liquid-to-material ratio on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.2超聲時間對茶色素得率的影響由圖2可知，超聲時間的延長對提高信陽毛尖茶色素的得率有一定的影響，在30～90min之間，得率呈上升趨勢，而在90～150min之間得率趨于平衡。因此，提取時間宜控制在90～150min內。

圖2　不同超聲時間對茶色素得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic time on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.3超聲溫度對茶色素得率的影響由圖3可知，隨著溫度在30～120℃之間的升高，信陽毛尖茶色素的得率顯著增加，其原因可能與溫度越高，茶色素擴散到溶劑中的速度越快以及茶葉中本身含有的簡單多酚氧化轉化為聚合多酚形式的茶色素越多有關。從實際生產情況考慮，超聲溫度不宜超過100℃。

圖3　不同超聲溫度對茶色素得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment

2.1.4提取次數對茶色素得率的影響由圖4可知，信陽毛尖茶色素的得率受到提取次數的影響，隨著提取次數的增多，得率增加，在提取3次后得率可以達到25.1%，但3次差異較小，所以本實驗綜合分析之后，選擇提取1、2、3次來做進一步考察。

圖4　提取次數對得率的影響Fig.4　Effect of extraction times on extraction rate

2.2信陽毛尖茶色素提取條件的優化

由表2可以看出影響茶色素得率的因素大小依次為A＞D＞C＞B，即料液比、提取次數、超聲溫度、超聲時間。由正交實驗可以得到各因素的最優組合為：A2B2C1D3，即料液比1∶30、超聲時間120 min、超聲溫度80℃、提取次數3次。三次驗證實驗得率分別為：33.5%、33.1%、32.8%，平均得率為33.1%±0.4%。大于9組實驗中的任意組，為最佳組合。

2.3信陽毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性

在本實驗中，抗氧化劑將穩定的DPPH自由基（紫色）還原為非自由基形式的DPPH-H（黃色）［19］。信陽毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性的結果如圖5所示。由圖5可知，樣品的DPPH自由基清除活性隨著樣品濃度的增加而增加。在樣品濃度為100 μg/mL時，信陽毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性是80.38%，明顯低于VC（p＜0.05），VC是被公認的具有最強DPPH自由基清除活性［7］，因此信陽毛尖茶色素具有較強的DPPH自由基清除活性。

表2　正交實驗的結果Table 2　Results of orthogonal test

圖5　信陽毛尖茶色素的DPPH自由基清除活性Fig.5　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on DPPH free radical

2.4信陽毛尖茶色素的超氧自由基清除活性

在本實驗中，超氧自由基產生于PMS/NADH體系，并與NBT發生還原反應，通過測定反應混合物的吸光度值的降低來計算超氧自由基的清除活性。信陽毛尖茶色素的超氧自由基清除活性的結果如圖6所示。由圖6可知，隨著樣品濃度的增加，超氧自由基的清除活性逐漸升高。在樣品濃度為100 μg/mL時，信陽毛尖茶色素的超氧自由基清除活性是85.33%，因此信陽毛尖茶色素具有較強的超氧自由基清除活性。

圖6　信陽毛尖茶色素的超氧自由基清除活性Fig.6　Scavenging activity of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on superoxide radicals

2.5信陽毛尖茶色素的羥基自由基清除活性

在本實驗中，羥基自由基是通過Fenton反應體系產生的。羥基自由基能氧化Fe2+成為Fe3+，而只有Fe2+能和1，10-菲咯啉形成1，10-菲咯啉-Fe2+的復合體，因而通過測定反應體系吸光度值的降低可以計算出羥基自由基清除活性［20］。信陽毛尖茶色素的羥基自由基清除活性的結果如圖7所示。由圖7可知，隨著樣品濃度的增加，羥基自由基的清除活性逐漸升高。在樣品濃度為100 μg/mL時，信陽毛尖茶色素的羥基自由基清除活性是88.68%，因此信陽毛尖茶色素具有較高的羥基自由基清除活性。

圖7　信陽毛尖茶色素的羥基自由基清除活性Fig.7　Scavenging effects of Xinyang Maojian pigment and ascorbic acid at various concentrations on hydroxyl radicals

3　結論

采用信陽毛尖為原料，通過單因素實驗，確定了在各因素水平下的最佳條件。由正交實驗可以得到各因素的最優組合為：料液比1∶30、超聲時間120 min、超聲溫度80℃、提取次數3次，此時茶色素的得率為33.1%±0.4%。因此，利用正交實驗對信陽毛尖茶色素提取工藝進行優化，可獲得最優的工藝參數，有效減少了工藝操作中的盲目性，從而為進一步的實驗研究提供參考。

用分光光度法對信陽毛尖茶色素清除體外自由基的能力進行了測定，測定結果表明信陽毛尖茶色素對DPPH自由基、超氧自由基、羥自由基有較強的清除作用，其清除體外自由基的能力由強到弱依次是：羥自由基＞超氧自由基＞DPPH自由基。因此，信陽毛尖茶色素具有良好的抗氧化作用，可以作為一種天然的抗氧化劑。

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Research of ultrasound-assisted extraction of Xinyang Maojian tea pigment and its antioxidant activity

LI Bin，WU Xiao-xue，MENG Yao-yao，WANG Li-bo
（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Objective：To optimize the extraction process for Xinyang Maojian tea pigment and explore its antioxidant activity.Methods：Effect of four factors on the extraction，including ratio of solid to liquid，ultrasonic temperature，ultrasonic time and extraction times were studied by single factor and the optimum extraction conditions were then determined through the orthogonal experiment.1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）free radical scavenging assay，superoxide and hydroxyl radical scavenging assay were used to evaluate the antioxidant activity of the pigment.Results：The order of factors to affect flavonoids extraction was ratio of material/solution＞extraction times＞ultrasonic temperature＞ultrasonic time.The optimal extraction conditions were material/solvent ratio 1∶30，extraction temperature of 80℃and extraction time of 120 min，for three times.Under such conditions，the yield of the melanin reached 33.1%.The Xinyang Maojian tea melanin exhibited a moderate antioxidant activity.It was clearly demonstrated that free radical scavenging increases with increasing melanin concentration. The melanin had strong scavenging activity on hydroxyl radical.Conclusion：The extraction rate of Xinyang Maojian tea pigment was improved by orthogonal experiment.The pigment had antioxygenation effect obviously，and it could be further developed and utilized as a natural antioxidant.

Xinyang Maojian tea；tea pigment；extraction；antioxidant activity

TS202.3

B

1002-0306（2015）18-0281-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.048

2015-01-30

李斌（1984-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術，E-mail：binbin27_lee@163.com。