超聲-微波協同提取荷葉總黃酮工藝優化及其提取效果分析

付　　洋，張良慧，江慎華，2，3，*，楊瓊玉，萬　　嚴，吳　　真，廖　　亮，馬海樂，2，沈勇根，3（.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇鎮江2203；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

超聲-微波協同提取荷葉總黃酮工藝優化及其提取效果分析

付洋1，張良慧1，江慎華1，2，3，*，楊瓊玉1，萬嚴1，吳真1，廖亮1，馬海樂1，2，沈勇根1，3
（1.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇鎮江212013；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

為優化超聲-微波協同提取荷葉總黃酮最佳工藝及解析其提取效率較高的原因，本文通過單因素、正交實驗對提取工藝進行優化；通過比較協同提取、超聲與微波單獨提取及掃描電鏡對提取前后荷葉粉末微觀結構，初步解釋了該技術提取效率較高的原因。結果表明，超聲-微波協同提取荷葉總黃酮最佳工藝條件為：提取時間5 min、微波功率125 W、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、超聲功率50 W（開）。對比實驗發現，在各自最佳提取條件下，協同方法提取荷葉總黃酮效率顯著高于水浴振蕩提取法（p＜0.001）；超聲與微波單獨提取分析發現，協同提取技術結合了超聲和微波二者優勢、互補產生較高效率提取作用；掃描電鏡觀察發現，協同提取對原料細胞壁破壞更嚴重、作用更充分，從而增強了提取效率。超聲-微波協同技術對荷葉總黃酮具有較高的提取效率，值得后續深入研究與開發。

荷葉，總黃酮，超聲微波協同提取，掃描電鏡

荷葉，為睡蓮科植物蓮（Nelumbo Nucifera Gaertn）的葉片［1］，廣泛分布于我國及東亞等地，為國家公布的藥食兩用植物［1］。其有效成分主要包括黃酮類化合物和生物堿兩大類，具有抗氧化、減肥、降血脂、降血糖、抗菌等功效［2-3］。國內外很多學者對荷葉總黃酮提取技術與工藝進行了相應的研究或優化［4］。

超聲波提取技術具有良好的空化效應和機械效應，可有效破壞植物細胞壁，使溶劑滲入細胞內部，增強溶劑與有效成分的接觸，促使有效成分溶出，在植物有效成分提取中發揮重要作用［5］。微波能產生良好的熱效應，使細胞內的極性物質產生大量熱量，促使胞內溫度迅速上升，水氣化產生壓力使細胞壁破裂、產生微孔或裂紋，從而使細胞內有效成分更容易被溶出［5］。盡管超聲、微波輔助提取具有上述優點，但是，超聲提取熱效應不強，難以達到提取溫度；微波提取存在傳熱不均等問題［5］。而超聲-微波協同提取技術正好將這兩種方法進行結合，實現優勢互補、彌補兩者劣勢，具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點，從而可獲得更高的提取效率［5］。Li［6］在提取擬除蟲菊酯的過程中發現超聲-微波協同提取具有更好的效果。Cheng［7］在提取雞血藤總黃酮時發現，超聲-微波協同提取效率遠高于傳統方法。盡管以上學者［5-7］發現超聲-微波協同提取各自有效成分效率很高，但是，這種技術提取荷葉總黃酮是否也同樣具有很高的效率目前尚未見相關報道。

本實驗室前期對國家公布的藥食兩用原料篩選后發現，荷葉具有較高的總黃酮含量和抗氧化活性［8］，并對水浴振蕩提取、超聲提取、微波提取荷葉總黃酮進行了分析和比較［1］。但是，采用超聲-微波協同技術提取荷葉總黃酮工藝未見相關報道，其提取具有很高效率的作用機制仍不明確。

因此，本文在實驗室前期基礎上，首先對超聲-微波協同（UMAE）提取荷葉總黃酮工藝進行了優化，進而和傳統工藝進行對比，并通過超聲與微波單獨提取實驗和掃描電鏡初步分析了較高效率作用機理，為后續探索荷葉總黃酮提取提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

荷葉亳州市豪門中藥飲片有限公司，產地山東，生產批號130401，生產日期2013年4月30日，藥材買回后立即粉碎，過60目篩后置干燥箱中備用；1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH，1，1-Dipheny-l-2-picrylhydrazyl，純度≥97%）Sigma公司；三吡啶三吖嗪（Tripyridyl triazine，TPTZ，純度≥98%）阿法埃莎（天津）化學有限公司；蘆丁（純度≥95%） 國藥集團化學試劑有限公司；其余化學試劑國產分析純或優級純。

VEGA（Ⅱ）LSU型掃描電子顯微鏡捷克（TESCAN）泰思肯公司；CW-2000型超聲-微波協同提取儀上海新拓分析儀器科技有限公司（微波功率0～800 W任意可調，頻率2450 MHz；超聲功率固定50 W，頻率40 KHz）；SHA-B型恒溫振蕩器常州國華電器有限公司；UNIC 7200型可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司；101-1AB型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有公司。

1.2實驗方法

1.2.1超聲-微波協同提取工藝流程稱取7.000 g荷葉粉末，采用超聲-微波協同萃取儀通過改變提取時間、微波功率、乙醇濃度與料液比進行提取，共提取3次，提取液合并、定容成統一體積（500 mL），稀釋5倍后測定總黃酮含量以評價提取效率。

1.2.2超聲-微波協同提取荷葉總黃酮單因素實驗設計按照表1中提取時間、微波功率、乙醇濃度和料液比進行單因素實驗。

表1　超聲-微波協同提取荷葉總黃酮單因素實驗Table 1　The univariate experiments of UMAE for extacting total flavonoids from lotus leaf

1.2.3正交實驗設計以單因素實驗結果為參考，設計4因素3水平（L9（34））的正交實驗，其因素水平如表2所示，以總黃酮含量衡量提取效率。

1.2.4荷葉提取液總黃酮及抗氧化活性測定采用江慎華［9］方法，測定總黃酮含量及抗氧化活性FRAP值。

以蘆丁為標樣，配成濃度為0、25、50、100、200、400、600、800、1000 μg/mL九個濃度依據上述方法測定510 nm處測定吸光度值，繪制標準曲線。

將FeSO4·7H2O配成濃度為0、100、200、400、600、1000 μmol/L的樣液依據上述方法制作標準曲線。

1.2.5超聲-微波協同提取作用探究

1.2.5.1協同提取與水浴振蕩提取效率比較實驗室前期已確定荷葉總黃酮水浴提取最佳工藝［10］。本文在此基礎上將水浴振蕩（UMAE）最佳提取工藝和超聲-微波協同（WBSE）最佳提取工藝進行比較，具體對比參數設置如表3所示。

表2　超聲-微波協同提取荷葉總黃酮正交實驗Table 2　The orthogonal experiments of UMAE for extracting total flavonoids from lotus leaf

表3　荷葉總黃酮超聲-微波協同提取與水浴振蕩提取效率比較Table 3　The comparison between UMAE and WBSE for extracting total flavonoids from lotus leaf

1.2.5.2超聲-微波單獨提取荷葉總黃酮為了探究超聲-微波協同提取效率高的原因，本文將協同提取與單獨超聲（UAE）、單獨微波（MAE）輔助提取進行比較。具體參數設置見表4。

表4　荷葉總黃酮超聲-微波協同提取與單獨提取比較Table 4　The comparison analysis of extracting total flavonoids from lotus leaf among UMAE，UAE and MAE

1.2.5.3提取前后荷葉粉末掃描電鏡分析將四種方法提取前后連同原始樣品60℃干燥，取少量粉末在離子濺射儀中完成真空噴鍍后，采用掃描電鏡進行顯微結構分析。

1.2.6數據處理所有實驗均三次重復，結果以平均值±標準偏差表示。采用Excel和DPS軟件對實驗數據進行整理及統計分析。

2　結果與分析

2.1總黃酮含量及FRAP值測定標準曲線的繪制

采用1.2.4方法繪制總黃酮含量及FRAP值測定標準曲線如圖1所示。由圖1可見，總黃酮含量回歸方程為y（OD510）=0.0004x（μg/mL）+0.0283；FRAP值回歸方程為y（OD593）=0.0017x（μmol/mL）-0.051。這兩個回歸方程R2均高達0.99以上，線性關系良好。

圖1　總黃酮含量及FRAP值測定標準曲線Fig.1　The standard curve for determinations of total flavonoids contents and FRAP values

2.2超聲-微波協同提取荷葉總黃酮單因素實驗結果

2.2.1協同提取時間單因素實驗時間單因素實驗結果如圖2所示。從圖2可知，在提取時間3～6 min范圍內，提取液總黃酮含量隨時間增加逐漸增大，6 min以后隨著時間延長反而逐漸降低。可能是隨著時間的延長，一些溫度敏感性成分逐漸失去活性的緣故［11］。本實驗選定5、6和7 min作正交實驗。

圖2　提取時間對荷葉總黃酮超聲-微波協同提取效果的影響Fig.2　The effect of extraction time on the extraction efficiency of total flavonoinds from lotus leaf by UMAE

2.2.2協同提取微波功率單因素實驗微波功率單因素實驗結果如圖3所示。從圖3可知，在微波功率50～100 W范圍內，提取液總黃酮含量隨著微波功率增大逐漸增大。當提取功率大于100 W以后，總黃酮含量隨著時間增加逐漸降低。可能是隨著微波功率增大，產生的熱效應更強、溫度更高，某些熱敏性成分受到破壞導致提取率下降［11］。本實驗選定提取功率75、100和125 W作正交實驗。

圖3　微波功率對荷葉總黃酮超聲-微波協同提取效果的影響Fig.3　The effect of microwave power on the extraction efficiency of total flavonoinds from lotus leaf by UMAE

2.2.3協同提取乙醇濃度單因素實驗乙醇濃度單因素實驗結果如圖4所示。由圖4可以看出，在20%～70%濃度范圍內，總黃酮含量隨著濃度增大而上升，70%達最高，70%～90%范圍內反而下降。可能的原因是荷葉總黃酮類成分性質和化學結構不同，在不同濃度乙醇溶液中溶解度存在差異。本實驗選定乙醇濃度60%、70%和80%作正交實驗。

圖4　乙醇濃度對荷葉總黃酮超聲-微波協同提取效果的影響Fig.4　The effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of total flavonoinds from lotus leaf by UMAE

2.2.4協同提取料液比單因素實驗料液比單因素結果如圖5所示。如圖5可知，隨著料液比增大，總黃酮含量一直在增加，但是，當料液比大于1∶25后增勢趨緩，而溶劑消耗量繼續過大會導致成本增加。本實驗選定料液比1∶20、1∶25和1∶30進行正交實驗。

圖5　料液比對荷葉總黃酮超聲-微波協同提取效果的影響Fig.5　The effect of solvent to solid ratio on the extraction efficiency of total flavonoinds from lotus leaf by UMAE

2.3超聲-微波協同提取荷葉總黃酮正交實驗結果

根據2.2中單因素實驗確定的四因素三水平正交實驗測定結果如表5所示。由表5可以看出，影響協同提取效率各因素從大到小排序依次為：料液比＞微波功率＞提取時間＞乙醇濃度。最佳提取工藝為

A1B3C2D3，即提取時間5 min、微波功率125 W、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL和超聲功率50 W（開）。方差分析結果（表6）表明，這四個因素對提取結果均具有顯著性差異。

表5　超聲-微波協同提取荷葉總黃酮正交實驗結果Table 5　The orthogonal experiments for extracting total flavonoids from lotus leaf by UMAE

表6　超聲-微波協同提取荷葉總黃酮正交實驗方差分析Table 6　The analysis of variance for orthogonal experiments of total flavonoids from lotus leaf by UMAE

選取經正交實驗優化確定的超聲-微波協同提取最佳工藝（A1B3C2D3）與原正交實驗設計表中總黃酮含量最高的一組（A1B2C2D2）進行比較以驗證，結果如表7所示。由表7可見，正交實驗優化后的協同工藝提取液總黃酮含量比正交實驗表中最高組高出97.70 mg·g-1，具有極顯著性差異（p＜0.01），證明協同優化工藝結果可靠。

表7　超聲-微波協同提取荷葉總黃酮驗證實驗結果Table 7　The verification experiments of total flavonoids from lotus leaf by UMAE

2.4超聲-微波協同提取荷葉總黃酮作用分析

2.4.1超聲-微波協同提取與水浴振蕩提取效率比較由圖6可見，協同提取方法中荷葉原料提取液總黃酮含量高達451.7 mg/g，顯著高于水浴振蕩提取液（p＜0.001）；同時，協同提取液FRAP值也顯著高于水浴振蕩提取液（p＜0.001），其FRAP值是水浴提取液的1.05倍。通過對比結果發現，協同提取法顯著優于水浴振蕩提取方法。Zhou等［12］從石榴皮中提取粗多糖時比較了超聲-微波協同法和水浴振蕩法，也得出相似的結果。

圖6　超聲-微波協同、水浴振蕩最佳工藝提取效率比較Fig.6　The comparison of extraction efficiency between UMAE and WBSE

2.4.2超聲-微波協同提取與單獨提取效率分析超聲-微波協同提取與超聲、微波單獨提取比較實驗測定結果如圖7所示。從圖7可以看出，協同提取液總黃酮提出率較單獨微波及單獨超聲提取液分別高出3.03%和8.48%，具有極顯著性差異（p＜0.001）。協同提取液FRAP值比單獨微波及單獨超聲提取液分別高出4.62%和10.12%，具有顯著性差異（p＜0.05）。由圖7可見，協同提取效率均顯著高于超聲或微波單獨提取，是這兩種方法優勢互補、產生協同作用的結果。

圖7　單獨超聲、單獨微波和超聲-微波協同提取效率比較Fig.7　The comparison of extraction efficiency among UAE，MAE and UMAE

2.4.3掃描電鏡分析為了進一步闡明協同提取作用原因，在對比分析、協同提取與單獨提取比較實驗的基礎上，本文采用掃描電鏡對提取前后粉末微觀結構進行觀察后發現（圖8），荷葉粉末提取前顆粒較完整，樣品表面幾乎沒有孔洞。不同方法提取后樣品微觀結構均遭到不同程度破壞。其中，經協同作用后細胞無法識別，破碎程度比其他3種方法更嚴重，并產生很多直徑小于10μm的孔洞以利于有效成分快速溶出。其主要原因可能是超聲波產生的機械、空穴效應導致細胞壁破裂；微波使細胞內部溫度劇烈上升、急劇膨脹、細胞壁破裂，溶質流向有機溶劑［5］。而單獨超聲、單獨微波輔助僅能受到上述一種或幾種效應的作用，無法同時受到超聲、微波同時協同所產生的全部效應［5，13-14］，最終使得協同提取效率顯著性高于其他三種提取方法。這一結果與2.4.1與2.4.2中的比較實驗相互印證。Lou［15］比較超聲-微波協同和水浴振蕩提取牛蒡中多酚類化合物含量時，也從電鏡圖像中得出類似的結果。

圖8　荷葉粉末掃描電鏡圖（×5000）Fig.8　The pictures of scanning electron microscope（×5000）

3　結論

3.1通過單因素實驗和正交實驗確定了荷葉總黃酮超聲-微波協同提取最佳提取工藝：提取時間5 min、微波功率125 W、乙醇濃度70%、料液比1∶30 g/mL、超聲功率50 W（開），在此最佳條件下荷葉總黃酮提取得率達（437.46±2.04）mg·g-1。

3.2對比分析發現，超聲-微波協同最佳工藝提取效率顯著性高于水浴振蕩提取最佳工藝（p＜0.001）；比較實驗和掃描電鏡發現，超聲-微波協同提取效率高的原因在于超聲和微波兩種技術優勢相互補充、原料粉末在微觀結構上破壞更徹底，使得荷葉總黃酮迅速、充分溶出而顯著提高了提取效率。

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The optimization on extraction technology of total flavonoids from lotus leaves based on simultaneous ultrasonic/microwave assisted extraction and the analysis of high efficiency

FU Yang1，ZHANG Liang-hui1，JIANG Shen-hua1，2，3，*，YANG Qiong-yu1，WAN Yan1，WU Zhen1，LIAO Liang1，MA Hai-le1，2，SHEN Yong-gen1，3
（1.School of Pharmacy&Life Science，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products，Zhenjiang 212013，China；3.College of Food Science and Engineering，Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

The objective of the study was to optimize extraction technology of ultrasonic/microwave assisted extraction（UMAE）and to explain the reason for high-efficiency of this technology.The technology optimization was completed by the single factor experiment and orthogonal experiment of L9（34）.The reason for highefficiency was explained by the comparison experiment，splitting analysis and scanning electron microscopy（SEM）.The results of the optimal parameters of UMAE technology were the extracting time 5 min，the microwave power 125 W，the concentration of ethanol 70%，the solid-liquid ratio 1∶30 g/mL and the ultrasonic power 50 W（open）.Comparison experiment indicated that the extraction ratio of total flavonoids from lotus leaf by UMAE was significantly higher than that of water bath shaking extraction（WBSE）under both optimum conditions（p＜0.001）.It was also found that the highly efficient extraction of UMAE was simultaneously acted and mutually reinforced by ultrasonic and microwave by the splitting analysis.The materials and cell walls were more seriously destroyed so as to achieve higher extraction efficiency.UMAE was a extraction technology withhigh efficiency and worth of further research and development.

lotus leaf；total flavonoids；simultaneous ultrasonic/microwave assisted extraction；scanning electron microscopy

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0261-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.044

2014－12－19

付洋（1994-），男，本科，主要從事有效成分提取、分離、純化等方面的工作，E-mail：1151452070@qq.com。

江慎華（1973-），男，博士，副教授，主要從事天然產物研究與開發方面的工作，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

國家自然科學基金（31360371）；江西省自然科學基金（20132BAB204030）；江西省科技支撐計劃（20123BBF60150）；江蘇省農產品物理加工重點實驗室開放課題（JAPP2010-5）；江西省高等學校大學生創新創業計劃；江西省天然產物與功能食品重點實驗室開放基金；九江市科技支撐計劃（201438）。