三峽庫區烏皮香核桃隔膜皂苷提取及抗氧化測定

陳　林，王兆丹，曲留柱，金小勇，王小玉（重慶三峽學院生命科學與工程學院，生物與食品基礎實驗教學中心（市級實驗教學示范中心），重慶404100）

三峽庫區烏皮香核桃隔膜皂苷提取及抗氧化測定

陳林，王兆丹，曲留柱*，金小勇，王小玉
（重慶三峽學院生命科學與工程學院，生物與食品基礎實驗教學中心（市級實驗教學示范中心），重慶404100）

本實驗采用超聲波法，響應面設計提取三峽庫區特產核桃隔膜皂苷。結果顯示核桃隔膜中皂苷提取的最佳提取工藝參數為：提取功率300 W，提取時間為96 s，料液比為1∶33（g/mL），皂苷的提取得率為5.98%。通過DPPH，ABTS法對核桃隔膜皂苷提取物進行抗氧化實驗，表明皂苷提取物對自由基清除效果明顯，有較強的抗氧化活性。

核桃隔膜，皂苷，超聲波提取，響應面分析，抗氧化性

核桃隔膜又稱分心木（Juglans regia），為帶骨質內果皮的種隔，完整呈類圓形或橢圓形，直徑約2.5 cm。表面棕色至褐色，有光澤，邊緣增厚。體輕，質脆，易折斷，味微澀。用于腎虛遺精，滑精，遺尿，瀉痢［1-3］。目前國內外對核桃屬植物［4-7］藥用性研究較多，但對內隔膜的研究較少，導致其藥用價值未能充分認識造成資源浪費。

超聲波提取法最大優點是節約能源和時間。它利用超聲波的空化效應［8］，使植物活性成分在不被破壞的情況下溶出，且體系溫度不會大幅度升高。響應面分析方法（response surface methodology，RSM）是一種優化工藝條件的有效方法［9-10］，可用于確定各種因素及其交互作用在工藝過程中對指標（響應值）的影響，精確的表述因素和響應值之間的關系。本實驗主要針對三峽庫區核桃品種核桃隔膜皂苷提取物工藝學研究及功能初步測定，以期加深對其綜合利用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

核桃隔膜選自重慶城口烏皮香核桃，出油率達25%，取出核桃隔膜，然后用粉碎機將其打成粉末，過40目篩；薯蕷皂苷標準品（MUST-10102901）、無水乙醇色譜純。

JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機寧波新基生物科技股份有限公司；FZ102-微型植物粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-95B型循環水式多用真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-52旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；UV2450型紫外可見光分光光度計日本島津公司；AL-104電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的測定準確稱量薯蕷皂苷樣品5.4 mg，并定容至100 mL，從標準樣品中取出5 mL用70%的乙醇溶液定容至10 mL，依次取樣稀釋配制梯度濃度標準溶液。對標準溶液進行全波長掃描，檢測得出標準品的最佳吸收波長為210 nm，在該波長下檢測梯度標準液的吸光值，根據得到的吸光值及其溶液濃度，繪制標準曲線，擬合得線性回歸方程。

1.2.2核桃隔膜皂苷提取方法核桃隔膜粉碎后，用電子天平精確稱量1 g樣品，并按一定料液比加入70%的乙醇溶液進行超聲波提取，將提取后的溶液用旋轉蒸發儀濃縮；稀釋后，在210 nm下測定樣品的吸光值Ac，帶入標準曲線計算出樣品皂苷提取當量，再計算核桃隔膜皂苷提取得率。

1.2.3回收率實驗精密稱取薯蕷皂苷標準品，配制標準溶液，按照1.2.2方法測定吸光度值，帶入回歸方程計算總皂苷含量。

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1提取時間的確定在超聲波功率為275 W，料液比為1∶30（g/mL）條件下，用超聲波細胞粉碎機依次提取0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25 min；并計算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取時間的變化趨勢。

1.2.4.2提取功率的確定在料液比為1∶30（g/mL），提取1.5 min，設置功率為175、200、225、250、275、300、325、350 W分別提取，并計算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取功率的變化趨勢。

1.2.4.3料液比的確定在超聲波功率為275 W，料液比依次為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）的條件下，提取1.5 min，并計算皂苷提取得率，確定提取得率隨提取料液比的變化趨勢。

1.2.5響應面試驗在單因素實驗的基礎上分別以提取功率、提取時間及料液比3個因素為考察對象，以皂苷提取得率為響應值，采用響應分析進行提取條件的優化。

表1　核桃隔膜皂苷提取響應面實驗因素與水平Table 1　Factors and levels of central composite test on extraction of saponins

1.2.6核桃隔膜對DPPH自由基清除作用準確移取3.9 mL 25.61 mg/L的DPPH溶液，加入0.1 mL體積分數70%的乙醇溶液，混勻，在517 nm波長處測吸光度（Ac）。將各待測樣品用相應的提取溶劑配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL，分別準確移取0.1 mL不同濃度的各樣品溶液，加入3.9 mL DPPH溶液（25.61 mg/L），混合均勻，室溫避光反應30 min后于517 nm處測定吸光度（Ai）。同時測定3.9 mL體積分數70%乙醇溶液中加入0.1 mL不同濃度樣品溶液的吸光度（Aj）［11］，以BHT作為陽性對照。DPPH清除率按以下公式計算：

1.2.7核桃隔膜對ABTS自由基清除作用取5.0 mL 7 mmol/L的ABTS+溶液，加入88.0 μg 140 mmol/L的過硫酸鉀在室溫下置于暗處反應12～16 h，形成ABTS+自由基儲備液。在734 nm處，用體積分數70%的乙醇將ABTS+自由基儲備液稀釋至吸光度為0.70±0.02備用。準確量取0.1 mL濃度10、20、40、80、160 μg/mL的樣品溶液，加入3.9 mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應6 min后734 nm處測定吸光度AE［12-14］。同時吸取3.9 mL ABTS+溶液，加入0.1 mL體積分數70%的乙醇溶液于734 nm處測定吸光度AB。ABTS自由基清除率計算公式如下：

1.2.8數據處理每一組實驗至少重復三次計算平均值。單因素及抗氧化實驗數據采用Excel 2007統計并作初步處理，結果用平均值±標準偏差表示。使用軟件SAS 9.2對數據分析處理并繪制響應曲面和等高線。

2　結果與討論

2.1標準曲線的測定

將配制好的不同濃度薯蕷皂苷標準品對照溶液在210nm波長處測定吸光度A，得到回歸方程Y= 2.548X-0.003，R2=0.9995。表明皂苷濃度在0.005～0.0135 mg/mL范圍內線性良好。

2.2回收率實驗

精密稱取薯蕷皂苷標準品，配制標準溶液，按照1.2.3方法測定皂苷回收率為99.29%±0.07%，由此可見該標曲具有很高的可靠度，可用于皂苷含量的檢測。

2.3核桃隔膜皂苷提取的單因素實驗

圖1～圖3分別為不同提取功率、提取時間及料液比下核桃隔膜皂苷的提取得率。隨著超聲波功率的增加，得率呈增加趨勢，且在275 W達到最大，之后得率隨功率的增加呈下降趨勢。

超聲功率275 W，料液比1∶30的條件下，核桃隔膜皂苷提取得率呈先增加后下降趨勢。當提取時間超過1.5 min，皂苷溶解度達到飽和狀態，皂苷提取得率反而逐漸下降。隨著超聲時間延長，植物細胞被破壞，內容物流出影響皂苷提取得率，故此條件下提取1.5 min提取得率最高。

圖1　不同提取功率對隔膜皂苷提取得率的影響Fig.1　Effect of extraction power on the extraction efficiency of extraction rate

圖2　不同提取時間對隔膜皂苷提取得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on the extraction efficiency of extraction rate

圖3　不同料液比對隔膜皂苷提取得率的影響Fig.3　Effect of extraction material/liquid ratio on the extraction efficiency of extraction rate

超聲功率275 W，提取時間1.5 min的條件下，料液比從1:10提高到1:30時，提取得率從0.372%增加到2.05%，進一步提高料液比，提取得率下降。

2.4響應面實驗

超聲波輔助提取核桃隔膜皂苷的響應面實驗結果見表2，對表2數據進行回歸分析，回歸模型的方程為：

對該響應面回歸模型進行方差分析（表3）。從此模型的方差分析表可知，響應面回歸模型達到極顯著水平（p=0.0013＜0.05），復相關系數R2為0.9251，說明該二次模型能夠擬合真實的實驗結果，實驗誤差小。

表2　核桃隔膜皂苷提取響應面實驗設計方案及結果Table 2　Experimental design and result of central composite test on extraction of saponins

表3　回歸方程的方差分析表Table 3　Analysis of variance of the regression model

表4　二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果Table 4　Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

從二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗結果（表4）可知，在所選的各因素水平范圍內，對結果影響因素大小順序為：提取時間、提取功率、料液比。由顯著性檢驗可知，其中對Y的影響極顯著（p＜0.01），X1、X2、X3、X12對Y的影響顯著（p＜0.05），X1X2、X1X3、X2X3對Y的影響不顯著。

圖4　因素交互作用對核桃隔膜皂苷提取得率影響的響應曲面Fig.4　Response surface plots for the effects of process parameter on the extraction efficiency of saponins

表5　烏皮香核桃提取物清除DPPH、ABTS自由基能力Table 5　Antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH、ABTS+of Wu walnut

根據回歸方程做出響應面圖（圖4）可直觀反映出各因素對響應值的影響。由圖4可知，各因素之間的交互作用對核桃隔膜皂苷提取得率均具有一定的影響，但均不顯著。

由SAS 9.2統計軟件分析得到響應值Y的最大估計值為5.98%，此時提取功率、提取時間、料液比對應的編碼值分別為X1=0.606882、X2=0.106907、X3=0.160032，即提取功率300.978 W，提取時間為1.590 min，料液比為1∶32.689。為實驗方便性選擇提取功率300 W，提取時間為96 s，料液比為1∶33（g/mL），對核桃隔膜皂苷提取進行驗證實驗得到實際提取得率為5.83%，與預測值非常接近，相對誤差為2.5%。

2.5烏皮香核桃隔膜抗氧化性分析

DPPH·是一種以氮為中心的穩定紫色自由基，在620 nm處有強吸收。ABTS與一定濃度的過硫酸鉀在暗處反應12～16 h經活性氫氧化生成穩定的藍綠色陽離子自由基ABTS+，若加入具有抗氧化活性物質會與之發生褪色反應［15］。核桃隔膜皂苷的抗氧活活性實驗結果如表5所示。從表5可以看出，核桃隔膜提取物對自由基清除率隨質量濃度的增加而增強，呈一定的線性關系，R2分別為0.8915和0.9938。

3　結論

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，采用了3因素3水平的響應面分析方法，對核桃隔膜皂苷的提取工藝進行了優化，確定核桃隔膜中皂苷最佳提取工藝參數為：提取功率300 W，提取時間為96 s，料液比為1:33（g/mL）。在此條件下測得的實際提取得率為5.83%，與預測值的相對誤差為2.5%。同時得到了核桃皂苷提取得率與各因素變量的二次多項式回歸方程，該模型回歸極顯著，實驗擬合較好。因此利用響應面法優化核桃隔膜皂苷提取條件是可行的。抗氧化活性實驗表明，核桃皂苷對自由基清除效果明顯，有較強的抗氧化活性，核桃隔膜提取物對自由基清除率隨質量濃度的增加而增強，呈一定的線性關系，R2分別為0.8915和0.9938。

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Antioxidant activity of ultrasonic extraction isolates from three gorges reservoir area Juglans regia of Wu walnut

CHEN Lin，WANG Zhao-dan，QU Liu-zhu*，JIN Xiao-yong，WANG Xiao-yu
（Biotechnology and Food Basic Experimental Teaching Center（Municipal Experimental Teaching Demonstration Center）College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China）

The total saponins were examined in the dissepiment of Wu walnut.On the basis of single factor experiments with the method of ultrasonic-assisted extraction，optimal parameters of extraction process was researched by using response surface method.A mathematical model including material/liquid ratio，ultrasonic treatment time and extraction temperature was created.By typicality analysis，the optimum process conditions were as follows：the ultrasonic treatment time was 96 s，the ultrasonic power was 300 W and the material/liquid ratio was 1∶33（g/mL）.Under such conditions，an optimal total saponins yield of 5.98%was obtained.Saponins displayed strong antioxidant effect and scavenging capacity against DPPH，ABTS radical，and more strengthen with the increase in the concentration of total crude saponins extract.

Juglans regia；saponins；ultrasonic extraction；response surface method；antioxidant

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0248-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.041

2014－12－23

陳林（1986-），女，碩士，實驗師，主要從事食品化學，天然產物提取及活性方面的研究，E-mail：friendlin@126.com。

曲留柱（1984-），男，博士，主要從事食品科學方面的研究，E-mail：103881829@qq.com。

重慶市自然科學基金項目（CSTC2009BB5236）；12科研創新團隊建設三峽庫區農產品綠色保鮮技術；2014年重慶三峽學院科學研究青年資助項目（14QN26）。