響應(yīng)曲面法優(yōu)化茶葉籽油超聲輔助LVK脂肪酶酶解工藝

向小樂，余　　佶，楊萬根，向勇平，麻成金，*（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界47000；.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000；.湖南省古丈縣茶葉局，湖南古丈41600）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化茶葉籽油超聲輔助LVK脂肪酶酶解工藝

向小樂1，2，余佶2，楊萬根2，向勇平3，麻成金1，2，*
（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界427000；2.吉首大學(xué)食品科學(xué)研究所，湖南吉首416000；3.湖南省古丈縣茶葉局，湖南古丈416300）

對(duì)茶葉籽油的超聲波輔助LVK脂肪酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取LVK脂肪酶濃度、初始pH、酶解溫度和時(shí)間為考察因子，茶葉籽油水解率為響應(yīng)值，運(yùn)用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，并建立數(shù)學(xué)回歸模型。結(jié)果表明，優(yōu)化工藝條件為：超聲功率220 W，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，油水比1∶1.75（w/v），氯化鈣濃度0.25%，LVK脂肪酶濃度5.5%，酶解溫度49.5℃，初始pH9.4，酶解時(shí)間4 h。在此條件下，水解率實(shí)測(cè)值為83.15%，模型預(yù)測(cè)值為82.06%，水解效率高。

響應(yīng)面，茶葉籽油，超聲波，LVK脂肪酶，酶解

茶葉籽油不飽和脂肪酸含量高，與人體所需脂肪酸接近；具有防止血管硬化、高血壓等功能，2009年被批準(zhǔn)為“新資源食品”，開發(fā)價(jià)值較高［1］。與酸催化法、皂化-酸化法等相比，脂肪酶催化油脂水解，由于反應(yīng)條件溫和、效率高、產(chǎn)物雜質(zhì)少分離純化簡單而備受關(guān)注［2-3］；其不足之處主要表現(xiàn)為：脂肪酶成本高、重復(fù)利用性差，反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較長等。不同脂肪酶催化油脂水解的選擇特異性各異［3-4］，如脂肪酸［5］、鍵位、立體選擇性［6］等。目前，劉亞軒［3］研究了C.Lipolytica、Sigma-3126、生工PPL、CLL、Novo435、Amano-G等脂肪酶水解豆油；臧佳辰等［7］優(yōu)化了火麻油的脂肪酶Mucor javanicus酶解工藝條件；徐懷德等［8］研究了豬胰脂肪酶水解花椒籽油條件及動(dòng)力學(xué)；甘爭艷［4］研究了脂肪酶LVK、AY 30G及F-AP15水解紅花油，并認(rèn)為脂肪酶LVK及AY 30G無鍵位及脂肪酸選擇性，F(xiàn)-AP15具一定的酯鍵位選擇性；高巍等［9］研究了橄欖油的TLIM脂肪酶酶解特性等；暫無運(yùn)用脂肪酶LVK催化水解茶葉籽油的文獻(xiàn)報(bào)道。

超聲所產(chǎn)生的微射流能對(duì)非均相邊界層產(chǎn)生攪拌和混合作用，具有較好的空化、乳化效應(yīng)，可降低溶液粘度和張力、增加酶解體系中兩相的有效接觸界面，促進(jìn)油脂酶解［3，10］。超聲乳化體系中油水乳化液熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，分散相質(zhì)點(diǎn)小、界面積大，且能保持或促進(jìn)酶的生物活性［3］。Ramachandran KB等［10］對(duì)超聲乳化（加乳化劑）后棕櫚油酶解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，Meenal S Puthli等［11］研究了均質(zhì)乳化對(duì)蓖麻油酶解的強(qiáng)化作用。

本文在課題組前期研究脂肪酶TLIM水解茶葉籽油［12-13］的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）對(duì)超聲波乳化體系中的茶葉籽油LVK脂肪酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在通過超聲波和磁力攪拌的協(xié)同作用及運(yùn)用不同的脂肪酶來提高茶葉籽油的酶解效率以及為茶葉籽油的綜合加工利用和脂肪酶LVK的酶學(xué)性質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茶葉籽油湖南省古丈縣茶葉基地提供茶葉籽，機(jī)械壓榨制油；LVK脂肪酶（1.7×106U/g） 深圳市綠微康生物工程有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、無水乙醇等均為分析純。

JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；85-2A型數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力攪拌器金壇市白塔新寶儀器廠；雷磁PHSJ-4A型pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器廠；FA2004型電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1茶葉籽油酶解將所需配比的茶葉籽油、LVK脂肪酶及pH緩沖液于30 mL反應(yīng)釜中混勻，調(diào)節(jié)酶解溫度、磁力攪拌轉(zhuǎn)速，設(shè)置超聲波發(fā)生器參數(shù)，開始反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定水解產(chǎn)物酸值［14］，進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取均值。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以水解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初始實(shí)驗(yàn)條件為：磁力攪拌轉(zhuǎn)速R=800 r/min，脂肪酶濃度E酶=4%，酶解溫度T=50℃，氯化鈣濃度C鈣=0.1%，緩沖液初始pH=6.8，油水比θ=1∶1.5（w/v），酶解時(shí)間t= 2 h，依次以上一個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)得出的最優(yōu)條件替換初始實(shí)驗(yàn)條件，分別對(duì)超聲波功率（40、100、160、220、280、340、400 W）、攪拌轉(zhuǎn)速（0、200、400、600、800、1000 r/min）、LVK脂肪酶濃度（2.5%、3%、3.5%、4.5%、5%）、酶解溫度（45、50、55、60、65℃）、氯化鈣濃度（0、0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%、0.55%）、反應(yīng)初始pH（8.5、9、9.5、10、10.5）、油水比（1∶1、1∶1.25、1∶1.5、1∶1.75、1∶2）、酶解時(shí)間（2、2.5、3、3.5、4 h）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，探討各實(shí)驗(yàn)因子對(duì)茶葉籽油水解率的影響。

1.2.3響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)綜合考慮各因子的實(shí)際運(yùn)用意義及其對(duì)茶葉籽油水解率影響的大小，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、初始pH、脂肪酶濃度、酶解時(shí)間為考察因子，水解率為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab 16中CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲輔助茶葉籽油酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，各因素水平編碼值見表1。

表1　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平編碼表Table 1　Variables and coded levels used in the CCD

1.2.4水解率計(jì)算取一定量茶葉籽油或其酶解產(chǎn)物，參照GB/T5530-2005《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》和GB/T5534-2008《動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定》測(cè)定其酸值及皂化值，計(jì)算公式如下［3-4］：

式中：AV為乳化油樣酸值；CKOH為KOH濃度；V滴為所耗KOH體積；V空為對(duì)照實(shí)驗(yàn)所耗KOH體積；MKOH為KOH摩爾質(zhì)量；m樣為所取乳化液質(zhì)量；fo為乳化液中油所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：SV為茶葉籽油皂化值；AV0、AVt分別為酶解前后茶葉籽油酸值。

1.2.5數(shù)據(jù)處理單因素實(shí)驗(yàn)使用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行分析，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)使用Minitab 16軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1超聲功率對(duì)茶葉籽油水解率的影響超聲波對(duì)酶促催化反應(yīng)的作用機(jī)制緣于其振蕩能加速底物與酶的有效接觸及產(chǎn)物釋放［15］。由圖1知，茶葉籽油水解率隨超聲功率的增加呈指數(shù)型增長，當(dāng)其功率大于220 W后水解率增長變緩。這說明，超聲波的乳化效應(yīng)可能主要集中于低頻區(qū)段（＜220 W），在此范圍內(nèi)增大超聲波功率可大幅提高底物與酶的有效接觸，能在一定程度上提高脂肪酶催化活性，加速油脂水解。黃卓烈等［16］也認(rèn)為超聲波能提高酶分子動(dòng)能，增大其與底物有效碰撞頻率。因此，綜合考慮超聲波的能效及催化效率，選擇功率為220 W超聲進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1　超聲功率對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.1　Effect of ultrasonic power on tea seed hydrolysis

2.1.2攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)茶葉籽油水解率的影響如圖2所示，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速由0～200 r/min時(shí)，茶葉籽油水解率增長較快，由200～800 r/min時(shí)增長變緩；由800～1000 r/min時(shí)水解率增長基本趨平，因此，選擇攪拌轉(zhuǎn)速為800 r/min為宜。其原因可解釋為：油脂酶解為一界面激活反應(yīng)，磁力攪拌能增加油水酶之間的有效接觸界面；超聲波的空化和乳化效應(yīng)能使反應(yīng)物（油水酶）乳化均勻、充分接觸［4］；探頭式超聲波乳化能力較強(qiáng)，但作用范圍有限，將其與磁力攪拌混勻作用相結(jié)合，能更大限度地發(fā)揮兩者共同優(yōu)勢(shì)。

圖2　磁力攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)茶葉籽油水解的影響Fig.2　Effect of speed of magnetic stirring on tea seed oil hydrolysis

2.1.3脂肪酶LVK濃度對(duì)茶葉籽油水解率的影響如圖3所示，茶葉籽油水解率隨LVK脂肪酶濃度的增加呈對(duì)數(shù)型增長，在低酶濃度范圍內(nèi)茶葉籽油水解率增長較快，當(dāng)脂肪酶濃度達(dá)4.5%后增長趨于平緩，其原因可解釋為：脂肪酶液基本飽和，開始出現(xiàn)其自身的抑制現(xiàn)象。與因此綜合考慮水解效率及酶成本，選擇4.5%的LVK脂肪酶為宜。

圖3　LVK脂肪酶濃度對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.3　Effect of concentration of lipase LVK on tea seed oil hydrolysis

2.1.4酶解溫度對(duì)茶葉籽油水解率的影響脂肪酶最適反應(yīng)溫度主要取決于其種類和來源［15］，由圖4可知，LVK脂肪酶催化茶葉籽油水解的最適溫度為55℃。其原因可能為：在適當(dāng)范圍內(nèi)提高反應(yīng)溫度可降低油水間傳質(zhì)阻力，增強(qiáng)兩者間流動(dòng)互溶性及使活化的脂肪酶分子數(shù)增多，催化活性增強(qiáng)［17］；反應(yīng)溫度過高又能使酶分子中氫鍵或疏水鍵破壞，蛋白質(zhì)活性中心基本構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起脂肪酶失活［15，17］。

圖4　酶解溫度對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.4　Effect of temperature on tea seed oil hydrolysis

2.1.5氯化鈣濃度對(duì)茶葉籽油水解率的影響如圖5所示，添加適量氯化鈣能在一定程度上提高茶葉籽油水解率，而其過量又能抑制脂肪酶活性，這與文獻(xiàn)［3，18］所得結(jié)論相似。推測(cè)原因可能為：Ca2+與脂肪酸絡(luò)合成脂肪酸鈣（乳化劑），能增大油水反應(yīng)界面及降低產(chǎn)物濃度，使反應(yīng)平衡右移［18］；Ca2+與酶形成三元橋絡(luò)合物強(qiáng)化穩(wěn)定脂肪酶構(gòu)象，充當(dāng)酶與底物的連接橋梁；相反，過量Ca2+可通過提高反應(yīng)體系離子強(qiáng)度來改變酶構(gòu)象，從而降低酶活［19］。因此，選擇濃度為0.25%氯化鈣為宜。

圖5　氯化鈣濃度對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.5　Effect of concentration of CaCl2on tea seed oil hydrolysis

2.1.6初始pH對(duì)茶葉籽油水解率的影響酶促反應(yīng)最適pH是在特定條件下才有意義的參數(shù)，并不是固定常數(shù)［3］，緩沖液pH過高或過低均會(huì)使酶活性降低［3，19］。因?yàn)榉磻?yīng)體系的酸堿度會(huì)影響酶蛋白構(gòu)象，當(dāng)酶蛋白等電點(diǎn)與緩沖液pH相等時(shí)，有利于保持酶的活性［20］。由圖6可知，選擇初始pH為9.5較好。

圖6　初始pH對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.6　Effect of initial pH value on tea seed oil hydrolysis

2.1.7油水比對(duì)茶葉籽油水解率的影響油脂酶解是典型界面激活反應(yīng)［4］，底物油水配比直接影響兩者間接觸界面、酶解效率。由圖7可知，茶葉籽油水解率隨水含量增加，先增加后降低，油水比為1∶1.75水解率最高。因此，油水比選擇1∶1.75為宜。推測(cè)原因可能為：反應(yīng)體系中水含量較低時(shí)，酶濃度相對(duì)較高，油水酶接觸幾率大，但油不能被酶液充分飽和［17］；當(dāng)酶分子中只含一單分子水化層時(shí)，催化活性最佳［21］。

圖7　油水比對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.7　Effect of oil to water ratio on tea seed oil hydrolysis

2.1.8酶解時(shí)間對(duì)茶葉籽油水解率的影響由圖8知，茶葉籽油酶解前期水解率增長較快而后變緩。其可能原因是：油脂酶解是可逆反應(yīng)，初期（2～3 h）反應(yīng)物（油水酶）濃度高有利于平衡右移，隨酶解時(shí)間延長體系中產(chǎn)物不斷富集、濃度升高，導(dǎo)致平衡逆移及所產(chǎn)生的脂肪酸使體系pH下降，導(dǎo)致部分脂肪酶活性降低或失活［3］；酶解后期（3～4 h）反應(yīng)達(dá)平衡狀態(tài)，油脂基本水解完全［3］。因此，酶解時(shí)間選擇3 h為宜。在相同酶解體系中，與脂肪酶TLIM［13］需8 h左右方可使茶葉籽油水解率達(dá)70%（動(dòng)態(tài)平衡拐點(diǎn)）相比，LVK脂肪酶催化效率更高；這也間接佐證：LVK對(duì)油脂中脂肪酸鍵位無特異選擇性，而TLIM為1，3位選擇性脂肪酶。

圖8　酶解時(shí)間對(duì)茶葉籽油水解率的影響Fig.8　Effect of reaction time on tea seed oil hydrolysis

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及表1中實(shí)驗(yàn)因子水平編碼設(shè)計(jì)進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果及預(yù)測(cè)值見表2、方差分析見表3。

表2　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Design and results of central composite design

采用軟件Minitab 16對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合回歸分析得模型方程：Y=78.0786+0.997500A-0.910833B -1.17917C+0.820833D-0.0815179A2-0.437768B2-2.31652C2+0.0984821D2-0.651250AB+0.647500AC-0.0200000AD-0.0687500BC-0.378750BD-0.155000CD。由方差分析及相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)表3知，所建回歸模型p＜0.01（極顯著），回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9423，決定系數(shù)（調(diào)整相關(guān)系數(shù)）R2Adj=0.8919，失擬項(xiàng)p=0.112＞0.05（不顯著），說明該模型擬合程度較高，能在89.19%的變更范圍內(nèi)解釋茶油籽油的酶解情況；實(shí)驗(yàn)因子對(duì)茶葉籽油酶解的影響順序?yàn)椋篊（初始pH）＞A（LVK酶濃度）＞B（酶解溫度）＞D（酶解時(shí)間）。舍棄影響不顯著的實(shí)驗(yàn)因子，擬合公式簡化為：

2.2.2因素交互根據(jù)方差分析結(jié)果，利用Minitab 16對(duì)酶解反應(yīng)影響較顯著2交互因子進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖9、圖10，響應(yīng)曲面陡度及等高線與坐標(biāo)軸交點(diǎn)數(shù)能在一定程度上反映考察因子對(duì)響應(yīng)值影響大小。

表3　方差分析Table 3　Variance analysis

圖9　A-B因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.9　Response surface plot for the interaction of A and B

圖10　A-C因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Fig.10　Response surface plot for the interaction of A and C

由圖9、圖10知，因素C的曲面陡度及其等高線與坐標(biāo)軸的交點(diǎn)數(shù)大于A，因素A的曲面陡度及等高線與坐標(biāo)軸的交點(diǎn)數(shù)大于B，說明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值影響大小順序?yàn)镃＞A＞B，這與方差分析結(jié)果吻合。

2.2.3優(yōu)化工藝確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Minitab 16中響應(yīng)優(yōu)化器對(duì)茶葉籽油酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得優(yōu)化工藝為：X1=2，X2=-1.0714，X3=-0.1504，X4=2，經(jīng)編碼公式轉(zhuǎn)換成實(shí)際參數(shù)值為：LVK脂肪酶濃度=5.5%，溫度=49.643℃，pH=9.4248，時(shí)間=4 h。考慮實(shí)際操作情況，選取LVK脂肪酶濃度=5.5%，酶解溫度= 49.5℃，pH=9.4，時(shí)間=4 h，進(jìn)行驗(yàn)證三次實(shí)驗(yàn)，得茶葉籽油平均水解率為83.15%，模型理論預(yù)測(cè)值82.06%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.33%。說明在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，該模型擬合程度較好，對(duì)超聲波乳化體系中脂肪酶LVK酶解茶葉籽油的預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。

3　結(jié)論

茶葉籽油的超聲波輔助脂肪酶LVK酶解優(yōu)化工藝條件為：超聲功率220 W，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，油水比1∶1.75，氯化鈣濃度0.25%，LVK脂肪酶濃度5.5%，酶解溫度49.5℃，初始pH9.4，酶解時(shí)間4 h，水解率83.15%。與脂肪酶TLIM催化茶葉籽油水解相比［12-13］，本實(shí)驗(yàn)所用LVK脂肪酶活性高、催化效率強(qiáng)；可為高效快速制備油脂酶解產(chǎn)物及脂肪酶LVK的酶學(xué)性質(zhì)提供實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

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Response surface optimization of ultrasonic-assisted tea seed oil hydrolysis catalyzed by lipase LVK

XIANG Xiao-le1，2，YU Ji2，YANG Wan-gen2，XIANG Yong-ping3，MA Cheng-jin1，2，*
（1.Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering，Jishou University，Zhangjiajie 427000，China；2.Institute of Food Science，Jishou University，Jishou 416000，China；3.Tea Project Management Bureau of Guzhang County，Guzhang 416300，China）

In order to optimize the method of tea seed oil enzymatic hydrolysis by ultrasonic-assisted.Based on the single factor experiments，LVK lipase dosage，initial pH value and reaction temperature&time were selected as trial factors，the hydrolysis rate of tea seed oil was the response value，a central composite design was used to obtain a mathematical regression model for optimize the parameters of tea seed oil hydrolysis by lipase under ultrasonic.The results showed that the optimal parameters were obtained as follows：ultrasonic power 220 W，stirring speed 800 r/min，oil to water ratio 1∶1.75（w/v），CaCl2dosage 0.25% ，LVK lipase dosage 5.5%，temperature 49.5℃，initial pH value 9.4，reaction time 4 h.Under these conditions，the experimental hydrolysis rate was 83.15%and the model value predicted was 82.06%and a high efficiency of hydrolysis was exhibited in this study.

response surface；tea seed oil；ultrasonic；lipase LVK；enzymatic hydrolysis

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.039

2015－01－06

向小樂（1989-），男，碩士研究生，研究方向：森林食品加工與利用，E-mail：281946730@qq.com。

麻成金（1963-），男，碩士，研究方向：林產(chǎn)化學(xué)加工與利用，E-mail：machengjin368@126.com。

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3099）；2014年吉首大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（14JDY063）。