建鯉組織蛋白酶L的克隆表達、純化及活性特征鑒定

李　冉，陳治光，蔣然然，陳秀華，李樹紅，李　新，鐘海霞，但　靜（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

建鯉組織蛋白酶L的克隆表達、純化及活性特征鑒定

李冉，陳治光，蔣然然，陳秀華，李樹紅*，李新，鐘海霞，但靜
（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

首先采用TA克隆技術克隆建鯉組織蛋白酶L（Cathepsin L，CAT L）成熟肽基因片段并進行雙酶切鑒定，進而構建表達載體CAT L-pET-30a并轉入宿主菌E.coli BL21，經1 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）在37℃誘導2 h表達重組CAT L蛋白。而后經尿素梯度洗滌和鎳離子親和層析純化目的蛋白，并利用SDS-PAGE檢測誘導效果和純化過程。最后以熒光合成肽底物（Z-Phe-Arg-MCA）測活法鑒定建鯉重組CAT L的熱穩定性、pH穩定性，以及魚糜生產和凍藏中常用添加劑對其活性穩定性的影響。雙酶切鑒定結果表明成功克隆了目的基因片段，與鯉魚CAT L基因序列相似性為99.11%。SDS-PAGE分析表明經誘導、尿素梯度洗滌及親和層析后，成功獲得高度純化目的蛋白，分子量約28 ku。活性鑒定結果表明重組CAT L在20～50℃及pH3.0～6.5范圍內穩定；氯化鈉、焦磷酸鈉對重組CAT L活性的抑制作用呈現劑量依賴關系，而各濃度蔗糖、山梨醇則對其活性無明顯作用。本研究成功克隆、表達和純化了建鯉CAT L，并闡明了熱、pH及魚糜生產和凍藏中常用添加劑對該酶穩定性的不同影響。

建鯉，組織蛋白酶L，克隆表達，純化，活性特征

組織蛋白酶（Cathepsins，CATs）是一類溶酶體蛋白酶，其中CAT L是半胱氨酸蛋白酶家族中CAT L亞家族（其成員包括Papain、CAT L、CAT S、CAT K、CAT O、CAT W）的典型代表，具有強烈的內肽酶活性［1］。CAT L的適宜反應pH在3.0～6.5范圍內，其在中性和堿性環境下，非常不穩定，易失活［2］。

在食品領域，已知CAT L不僅在畜禽類屠宰后肉的成熟［3］、嫩化［4］中發揮重要作用，而且還與肉類加工制品品質相關［5］。目前對魚類CAT L的研究表明，其能夠破壞肌肉蛋白結構完整性，加速宰后魚肉片的軟化［6］，此外，因其水解魚糜凝膠的關鍵結構蛋白—肌球蛋白，是導致魚糜制品質構品質劣變的主要原因之一［7］。同時，也有研究表明內源性CAT L活性與臘魚［8］的特有質地、顏色及揮發性風味的形成有關，其酶活的降低限制了腌干鰱魚［9］風味物質生成。

建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）是我國主要淡水經濟魚類—鯉魚（Cyprinus carpio）的主導品種，具有生長快，產量高，肉質優等特點，以建鯉為原料，開發魚糜等各種水產加工制品的前景十分廣闊。鑒于上述CAT L在魚類加工制品中潛在作用，獲得建鯉CAT L并研究其生物活性特征，是分析其與魚肉及其制品品質關系，并依此改善品質的必要前提。此外，還可根據CAT L酶解活性特性，將其應用于動物水解蛋白或活性小肽［10-11］等的生產。

近年來有學者對魚類CATs克隆表達進行了研究，然而目前尚未見建鯉CAT L的相關報道。而對重組CAT L的研究，可為探索天然CAT L的性質，提供科學的信息及參考依據。為此，本研究首次進行了建鯉CAT L的克隆和原核表達，以及魚糜制品加工相關條件（加熱、pH、鹽、糖、醇）下，CAT L的活性變化的研究，以期為實際生產中，合理利用該活性特征，提高魚糜制品品質，提供科學依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）（約500 g/尾，鮮活健康）購于四川雅安農貿市場；表達質粒pET-30a、感受態大腸桿菌E.coli DH5α、大腸桿菌E.coli BL21（DE3） 均由四川農業大學食品學院水產品加工理論與技術實驗室制備保存；動物組織RNA提取試劑盒成都百菲特生物科技有限公司；PrimeScript ?RT reagent Kit試劑盒、pMD?19-T Vector試劑盒、限制性內切酶Nde I/Xho I 日本寶生物工程有限公司；質粒小提試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、DNA Marker（III、IV） 北京天根生化科技有限公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）美國Sigma-Aldrich公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG） 默克化工技術（上海）有限公司；鎳離子親和層析填料德國Qiagen公司；中分子質量蛋白Marker（14.4～94 ku）北京天根生化科技有限公司；熒光合成肽（Z-Phe-Arg-MCA）底物美國Sigma公司；氯化鈉、焦磷酸鈉、蔗糖、山梨醇（食品級） 成都益新食品科技有限公司；洗滌液Buffer A（含0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）、裂解液（含1 mmol/L PMSF、0.5%Triton X-100的buffer A）、透析液Buffer B（含0.5 mol/L NaCl，1 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）、Buffer C（含5%甘油的Buffer B）、Buffer D（含0.5 mol/L咪唑的Buffer C） 由四川農業大學食品學院水產品加工理論與技術實驗室配制。

ABI9700 PCR反應儀美國ABI公司；Mini Sub-Cell GT水平電泳槽、Mini Protein3垂直電泳槽、PowerPac3000電泳電源、Gel Doc2000凝膠成像系統、Biologic Duo Flow全自動中高壓層析系統美國Bio-Rad公司；Varioskan全波長熒光/比色掃描讀數儀美國Thermo Scientific公司。

1.2實驗方法

1.2.1CAT L基因引物設計根據Tsunemoto等［12］發表的鯉魚（Cyprinus carpio）相關序列（GenBank登錄號：AB128161.1），設計克隆建鯉CAT L成熟肽鏈基因序列的特異性上下游引物，上游引物為：CGCATATG GTCCCAAACAG，下劃線部分為Nde I酶切位點；下游引物為：ATCTCGAG GACGAGAGGGTAGCTAGCAG，下劃線部分為Xho I酶切位點。

1.2.2CAT L基因序列的分子克隆提取建鯉肌肉總RNA，進行RT-PCR反轉錄。以獲得的建鯉肌肉cDNA為模板，利用CAT L上下游引物，經PCR擴增（94℃預變性3 min，94℃變性40 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，進行35個循環，最后72℃延伸5 min）獲得目的基因片段，并進行1%的瓊脂糖電泳檢測。將純化回收的目的基因片段，連接至克隆載體pMD19-T，得到重組質粒CAT L-pMD19-T，轉化至感受態E.coli DH5α，經藍白斑篩選和Nde I/Xho I雙酶切鑒定檢測，將陽性克隆送Invitergen生物公司進行測序（以T7引物擴增、雙向全長測序）。采用DNAman 8.0軟件對該基因序列及推導的氨基酸序列進行同源性分析。

1.2.3表達載體CAT L-pET-30a的構建及重組菌的表達重組質粒CAT L-pMD19-T和表達質粒pET-30a，分別用雙酶切后，回收目的基因片段和載體片段，16℃連接16 h。連接產物轉化至感受態E.coli DH5α，進行陽性篩選，并以CAT L成熟肽序列引物進行菌液PCR檢測，鑒定表達載體的構建。

將成功轉入CAT L-pET-30a的E.coli BL21（DE3）重組菌株，接種在LB液體培養基（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，200 r/min過夜振蕩培養12 h。次日將菌液按1∶50接入LB液體培養基（含50 μg/mL卡那霉素），37℃，200 r/min培養3 h。當OD600為0.6時，加入1 mmol/L的IPTG，37℃誘導培養2 h。離心收集菌體，經洗滌液Buffer A，吹打混勻、洗滌離心后，按30 mL/g菌體加入裂解液，重懸沉淀，反復凍融3次，按0.3 mg/mL比例加入溶菌酶（100 mg/mL），37℃反應30 min。超聲破碎菌體，8000×g離心10 min，收集包涵體沉淀用于純化。

1.2.4重組CAT L的純化和鑒定使用0.5、1、8 mol/L的尿素溶液依次梯度洗滌包涵體，將最終溶解于8 mol/L的尿素的上清液使用Buffer B進行透析。而后經Ni2+-NTA親和柱（1.6 cm×10 cm）層析純化，Buffer C洗去不吸附的雜蛋白，Buffer D進行梯度洗脫，流速0.5 mL/min，收集目的蛋白。純化后的CAT L經20 mmol/L磷酸緩沖液（PBS）（pH7.4）透析、濃縮，-80℃凍藏備用。分別取誘導前后、尿素梯度洗滌、純化后的樣品，進行SDS-PAGE鑒定［13］（膠濃度14%）。

1.2.5重組CAT L的活性穩定性測定參考Li等［14］的方法測定重組CAT L的熱穩定性和pH穩定性。將CAT L酶液在pH5.5條件下，于20～80℃范圍內，每10℃為一個間隔，放置60 min，用冰水冷卻至4℃，測定其殘余酶活。將CAT L酶液在20℃下，于pH3.0～8.0的范圍內，每0.5個pH單位為一個間隔，放置60 min，然后將pH調回至反應pH5.5，測定其殘余酶活。酶活測定參考Barrett等［15］的方法，以熒光合成肽Z-Phe-Arg-MCA為底物，pH5.5，40℃反應10 min，激發波長為380 nm，發射波長為460 nm。

1.2.6鹽、糖、醇對重組CAT L活性穩定性的影響根據加鹽魚糜或魚糜擂潰時常用鹽濃度，以及魚糜抗冷凍變性劑的常用濃度，分別設置了不同終濃度的氯化鈉（0.5%、1%、2%）［16］、焦磷酸鈉（0.2%、0.5%）［17-18］、蔗糖（1%、2%、4%）［19］、山梨醇（2%、4%、8%）［20］，測定其對CAT L酶活性的影響，活性測定方法同1.2.5，重復測定三次。

1.2.7數據處理及統計分析采用SPSS 19.0數學軟件進行統計分析，計算各指標的平均值和標準差，采用One-Way ANOVA法進行差異顯著性分析。p＞0.05表示差異不顯著，0.01＜p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2　結果與討論

2.1建鯉CAT L基因序列的擴增

成功提取建鯉肌肉總RNA，結果如圖1所示。

圖1　建鯉總RNA電泳圖Fig.1　Electrophoresis results of total RNA in Jian carp

將建鯉總RNA反轉錄為單鏈cDNA，以此為模板進行引物擴增，所得片段在瓊脂糖電泳上呈現約665 bp的亮帶（圖2）。該擴增片段長度與已報道的鯉魚CAT L（Genebank登錄號：AB128161.1）成熟肽基因片段長度相符。

圖2　建鯉CAT L PCR電泳圖Fig.2　Electrophoresis results of Jian carp CAT L PCR amplification

2.2建鯉CAT L基因的克隆及測序結果

將重組質粒CAT L-pMD19-T經雙酶切鑒定，結果如圖3所示，酶切后的CAT L片段大小為665 bp，同CAT L基因序列的擴增結果一致。pMD19-T片段為2692 bp，也與預期結果一致。以上鑒定結果說明成功擴增并克隆了建鯉CAT L基因片段。

圖3　重組質粒CAT L-pMD19-T雙酶切檢測圖Fig.3　Double digestion dentification of recombinant plasmid CAT L-pMD19-T

對克隆的建鯉CAT L基因片段進行測序，得到的DNA序列及推測的氨基酸序列見圖4。將該測序結果與對應的鯉魚CAT L的成熟肽基因序列進行相似性對比，結果相似度為99.11%，且推測的氨基酸序列相似度為100%。

圖4　建鯉CAT L基因序列及推測的氨基酸序列Fig.4　The nucleotide and deduced amino acid sequences of CAT L

2.3表達載體CAT L-pET-30a的構建及CAT L的表達純化

對成功轉入CAT L-pET-30a的陽性菌株進行PCR檢測，結果見圖5，PCR擴增的目的片段大小約為665 bp，與克隆的CAT L基因片段長度一致，說明成功構建了表達載體。

將成功轉入CAT L-pET-30a的重組菌株E.coli BL21，進行誘導表達，表達產物經尿素溶液梯度洗滌后，上鎳柱親和層析進行純化，獲得目的蛋白。SDSPAGE對上述各步驟結果進行鑒定，如圖6所示，經IPTG誘導的重組菌體裂解物在26.0～33.0 ku間有明顯的表達條帶；經尿素溶液梯度洗滌去除了大部分雜蛋白，最終溶解在8 mol/L尿素中的上清液，雜帶明顯減少；經鎳柱親和層析純化后得到高純度的重組CAT L蛋白，條帶單一，分子量約為28 ku。Hu等［21］純化了鯉魚（Cyprinus carpio）背肌中的CAT L，SDSPAGE測定分子量為36 ku，這可能是其純化的CAT L為前體形式或酶-抑制劑復合物［22-23］，如Whang等［24］克隆了條石鯛（Oplegnathus fasciatus）CAT L全長序列，其前體形式分子量為38 ku；Benjakul等［25］純化了太平洋鱈魚（Gadus macrocephalus）54.2 ku的CAT L，是由37 ku形成的CAT L與15 ku的抑制劑組成的復合物。而Tsunemoto等［12］及Aranishi等［26］從鯉魚肝胰腺純化得到的CAT L與本研究中分子量一致，均為28 ku。

圖5　重組質粒CAT L-pET-30a菌液PCR電泳圖Fig.5　Electrophoresis results of PCR identification of the recombinant plasmid CAT L-pET-30a

圖6　重組CAT L誘導表達及純化過程的電泳檢測Fig.6　Detection of expression and purification of CAT L by SDS-PAGE

2.4CAT L熱穩定性和pH穩定性

重組建鯉CAT L的熱穩定性的測定結果（圖7）表明，CAT L具有較強的耐熱性，在20～50℃內穩定，尤其50℃放置1 h后，仍然殘留了約45%活性，60～70℃才開始逐漸失活。這與Hu等［21］的研究中，將純化后鯉魚（Cyprinus carpio）CAT L在50℃下孵育1 h后活性殘留約50%基本一致。而Liu等［27］純化了30 ku的鰱魚CAT L，其殘余活性在50℃僅約10%，說明鯉科不同魚種間CAT L熱穩定性存在較大差異。

圖7　重組CAT L的熱穩定性Fig.7　Profile of pH stability of CAT L

有研究表明，漂洗后的魚糜中仍殘留部分CAT L活性［28］，且鯉魚魚糜在（50～70℃）易發生熱誘導魚糜凝膠軟化（modori）［29］。盡管目前未見建鯉魚糜中CAT L活性情況的報道，但建鯉CAT L在50℃時仍可保持較高的活性，因此，推測此溫度下，建鯉CAT L能夠水解魚糜凝膠中的主要結構蛋白—肌球蛋白，破壞凝膠網絡結構，最終導致魚糜制品凝膠劣化［7］。

重組建鯉CAT L的pH穩定性測定結果（圖8）表明，CAT L具有較強的酸穩定性，在pH3.0～6.5范圍內穩定，pH5.5穩定性最強，pH7.0時開始失活，尤其在pH3.0及6.5下放置30 min后，仍然分別保持了約50%和40%的殘余活性。生產中通常將魚肉糜的pH調節到6.5～7.0，以獲得最大的凝膠形成能力，而建鯉CAT L在pH6.5時仍可保持較高的活性，說明其是建鯉魚糜制品質構品質形成的不利因素。

圖8　重組CAT L的pH穩定性Fig.8　Profile of pH stability of CAT L

2.5鹽、糖、醇對CAT L活性的影響

測定不同濃度的鹽、糖、醇對重組CAT L活性的影響，結果見表1。從表1發現，濃度1%以下的氯化鈉對CAT L活性幾乎無影響，而1%及2%的氯化鈉對CAT L活性有極顯著的抑制作用（p＜0.01），且呈現劑量依賴模式。濃度0.2%及0.5%的焦磷酸鹽，均十分有效地抑制了CAT L活性。不同質量濃度的蔗糖和山梨醇，對CAT L活性幾乎無影響。

魚糜制品生產中，通常要加入2%～3%的食鹽進行擂潰，可促進鹽溶性蛋白—肌原纖維蛋白的溶出，進而增加魚糜凝膠網絡結構的形成［16］。此外，魚肉蛋白在低溫條件下穩定性差，容易變性［30］，因此通常在冷凍魚糜加工中，加入抗冷凍變性劑，如0.2%～0.3%焦磷酸鹽、2%～4%蔗糖、4%山梨醇。這些糖、醇、磷酸鹽等可穩定臨界水從而減少冰晶的形成［18，31］，因此可以減輕蛋白的冷凍變性。

而在魚肉貯藏過程中，研究表明鯉魚背肌肉塊冰藏4 d后CAT L殘留86.25%活性［32］，于-20℃凍藏6周后CAT L仍殘留79.99%的活性［33］。對鯉魚魚糜的研究表明，魚糜中添加CAT L后魚糜凝膠強度顯著下降了24.33%［23］。鑒于上述CAT L在魚肉中的強殘留性及其對魚糜加工的不利影響，研究常用鹽及其濃度及魚糜抗冷凍變性劑對CAT L活性的影響，對于分析和合理控制魚肉、魚糜加工及冷凍過程中CAT L活性殘留，具有一定的參考和指導意義。

表1　不同濃度鹽、糖、醇對重組CAT L活性的影響Table 1　Effect of different salt ions，sugar，and alcohol on activity of CAT L

3　結論

成功克隆了建鯉CAT L成熟肽鏈基因片段，長度為665 bp，與鯉魚CAT L成熟肽鏈的堿基序列同源性為99.11%；成功構建表達載體CAT L-pET-30a，并獲得重組菌株E.coli BL21，其經1 mmol/L IPTG在37℃誘導2 h成功表達重組CAT L蛋白。經尿素梯度洗滌和Ni2+-NTA親和層析純化后，獲得高度純化目的蛋白，分子量約28 ku?；钚蕴卣麒b定表明，重組CAT L在20～50℃及pH3.0～6.5范圍內穩定；1%、2%的氯化鈉及0.2%、0.5%的焦磷酸鹽對CAT L活性起到極顯著（p＜0.01）的抑制作用，而不同濃度的蔗糖、山梨醇則對其活性無明顯影響。

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Clone，expression，purification and activity characterization of Jian carp（Cyprinus carpio var.Jian）Cathepsin L

LI Ran，CHEN Zhi-guang，JIANG Ran-ran，CHEN Xiu-hua，LI Shu-hong*，LI Xin，ZHONG Hai-xia，DAN Jing
（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

CAT L gene fragment which encoded mature peptide of Jian carp was cloned using TA clone and characterized by double enzyme cutting firstly，prokaryotic expression vector CAT L-pET-30a was constructed and transformed into E.coli BL21 subsequently.Recombinant CAT L was expressed after induced by 1 mmol/L IPTG at 37℃ for 2 h.And the objective protein was gradiently washed by urea and purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography，SDS-PAGE was conducted to examine the results of expression and purification.Activity assay（Z-Phe-Arg-MCA as a substrate）was finally used to characterize the pH and thermal stability of CAT L，and illustrated the effects of common additives used in surimi product and frozen storage on its activity stability.The results of double enzyme cutting indicated that CAT L gene fragment was successfully cloned，and shared 99.11%sequence identities with the CAT L of common carp.The analysis of SDS-PAGE illustrated that the recombinant CAT L with the molecular weight of 28 ku was highly purified. Activity assay revealed that CAT L was stable ranging from 20℃to 50℃and pH 3.0 to 6.5，the activity of CAT L was inhibited by NaCl and Na4P2O7and appeared dose-dependence，while sucrose and sorbitol had no effects on the activity of CAT L.CAT L of Jian carp was successfully cloned，expressed and purified，and effects of heat，pH，additives on the activity stability of CAT L was illustrated.

Jian carp；Cathepsin L；clone and expression；purification；activity characterization

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0233-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.038

2015－01－16

李冉（1991-），男，碩士研究生，研究方向：水產品加工理論技術，E-mail：venn2017@163.com。

李樹紅（1975-），女，博士，副教授，研究方向：水產品加工理論與技術，E-mail：xiaoshu928@126.com。

四川省科技支撐計劃項目（2014NZ0003）；四川省教育廳自然科學重點基金項目（10ZA052）。