煎餅發酵面糊中酵母菌的鑒定及保護劑配方的優化

唐明禮，王　勃，劉　賀，何余堂，惠麗娟，馬　濤（渤海大學化學化工與食品安全學院，渤海大學糧油科學與技術研究所，遼寧錦州121013）

煎餅發酵面糊中酵母菌的鑒定及保護劑配方的優化

唐明禮，王勃，劉賀，何余堂，惠麗娟，馬濤*
（渤海大學化學化工與食品安全學院，渤海大學糧油科學與技術研究所，遼寧錦州121013）

從煎餅發酵面糊中分離篩選出具有當地特色及自然發酵煎餅風味的酵母菌菌株。其中Y8生長迅速且耐酸性強，采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對其進行鑒定，并對其制備凍干菌發酵劑的保護劑進行篩選和優化。結果表明，煎餅發酵面糊中酵母菌為釀酒酵母菌，保護劑優化配方：甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優化條件下，釀酒酵母菌的存活率可達82%，為傳統食品的連續化、工業化生產提供依據。

酵母菌，鑒定，保護劑，配方優化

煎餅是我國傳統食品之一，深受國人喜愛。制作過程中沿用自然發酵面糊進行生產，造成產品質量不穩定，難于實現標準化工業生產。

直投式發酵劑是對優勢菌種進行高密度培養，然后進行真空冷凍干燥制成的高活性菌體產品，具有菌種保質期長、活性高、接種量少、產品質量穩定等優點，廣泛應用于面包、泡菜、發酵奶制品等食品工業中［1-3］。凍干過程可導致冰晶的形成、細胞膜通透性的改變、敏感蛋白的變性與失活等，從而導致微生物的死亡。通過添加多糖、羥基化合物、蛋白質、聚合物等保護劑能夠降低結晶率、提高最大凍結濃縮液的玻璃化轉變溫度，提高凍干菌的存活率［4-7］。國內采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對菌種的鑒定及酵母菌冷凍干燥保護劑方面的研究鮮有報道，王華等［8］對熱帶假絲酵母進行了保護劑配方的優化研究，在最佳條件下，熱帶假絲酵母的存活率可達82.7%。

酵母菌凍干發酵劑具有含菌量高、活力強、體積小等優點，可減少煎餅等傳統發酵食品的生產成本，提高產品的食用安全性，有利于煎餅的工業化及連續化生產。目前，關于酵母菌的凍干保護劑發面的研究以及VITEC-2 compact微生物鑒定儀對菌種鑒定方面的研究比較少。

本文對煎餅發酵面糊中的酵母菌進行鑒定，通過單因素實驗和響應面法優化保護劑配方，以期為煎餅產品工業化生產奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

酵母菌由實驗室分離保藏；海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甘油食品級，連云港友進食品添加劑技術開發有限公司；脫脂乳食品級，黑龍江完達山乳業股份有限公司；乳糖分析純，天津市化學試劑工廠；葡萄糖分析純，天津市天利化學試劑有限公司；蔗糖食品級，龍舟南華糖業有限公司；硫酸錳分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；YEPD培養基北京奧博星生物技術有限責任公司；YST鑒定卡片法國梅里埃。

VITEC-2 compact微生物鑒定儀法國梅里埃；FreeZone臺式真空冷凍干燥機上海珂淮儀器有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機美國THERMO；GMSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器北京市永光明醫療儀器有限公司；SW-CJ-2FD型無菌操作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋金壇市鑫鑫實驗儀器廠；AR224CN型電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；MDF-382E（CN）型超低溫冰箱日本三洋。

1.2實驗方法

1.2.1菌株的生長曲線將分離的菌株以2%（v/v）的接種量接種于250 mL的液體培養基中，在28℃恒溫培養箱中培養，每2 h取出培養液，以未接種的培養基為空白對照。分別在波長660 nm處測量吸光值，以時間為橫坐標，菌液吸光度為縱坐標，觀察菌株的生長曲線。

1.2.2菌株的耐pH實驗將酵母菌接入YEPD液體培養基中，將培養基的pH分別調為2.5、3、3.5、4和4.5。按2%接種量接入活化好的酵母菌，以時間為橫坐標，菌液吸光度為縱坐標，觀察酵母菌的生長曲線。考察各菌株對pH的耐受性。

1.2.3VITEC-2 compact微生物鑒定儀對酵母菌的鑒定酵母菌菌種在4℃的條件進行保藏，測試前將YEPD固體培養基上的單菌落懸浮于0.45%的滅菌生理鹽水中，并用濁度儀確定濁度為1.8～2.2，將YST卡片插入此菌懸浮液中進行鑒定。YST卡片首先進入填充倉進行填充，使菌懸液進入卡片試劑中，填充完成將卡片放入切片分裝倉，儀器進行自動切片、封裝，將卡打入孵育倉，此后儀器每15 min自動讀卡檢測一次，檢測完畢后將自動打印報告單。

1.2.4工藝流程斜面菌株→活化→擴大培養→離心濃縮→制備菌懸液→活菌計數→加入保護劑→預凍→真空冷凍干燥→產品→活菌計數。

1.2.5單一保護劑的制備與選擇將保護劑按照表1中相應的濃度進行配制，在121℃、15 min的條件下滅菌備用。以生理鹽水為對照，測定凍干前后活菌數，計算存活率。

表1　保護劑的種類與用量Table 1　The type and amount of protective agent

1.2.6菌體的培養與收集將斜面上的菌株接種至含有YEPD液體培養基的三角瓶中，28℃靜置培養12 h，將10 mL菌液加入到100 mL YEPD液體培養基中進行擴培，使培養液的含菌量達到108CFU/mL。將培養液以8000 r/min、4℃的條件下離心10 min，棄去上清液，以一定量的無菌生理鹽水清洗菌泥。

1.2.7真空冷凍干燥在無菌的條件下，菌液與保護劑的比例為1∶1條件混合，保護劑與酵母菌懸液平衡時間為30 min，-70℃預凍2 h，之后進行真空冷凍干燥。冷凍干燥的參數：220 Pa、-50℃。

1.2.8凍干前后活菌數的計算將酵母菌離心后的懸浮液和凍干后的菌粉梯度稀釋，平板計數法記錄菌落數［9］。

1.2.9存活率的計算實驗結果以存活率表示，分析真空冷凍干燥對酵母菌的影響［10-11］。

式中，N：真空冷凍干燥后酵母菌的數量；N0：真空冷凍干燥前酵母菌的數量。

1.2.10響應面分析在單因素實驗結果的基礎之上，采用Box-Behnken實驗設計方案，以甘油、海藻糖、脫脂乳為考察變量，分別以X1、X2、X3表示，以存活率Y為響應值，因子編碼及各自變量水平見表2。

表2　實驗因素水平及編碼Table 2　Code and level of factors chosen for the trials

1.3數據處理

應用Design Expert 8.0.6軟件進行數據處理，p＜0.05認為具有顯著差異。

2　結果與分析

2.1菌株的生長曲線

圖1　酵母菌的生長曲線Fig.1　Growth curve of yeast

從煎餅發酵面糊中分離篩選11種酵母菌，分別對其編號為Y1～Y11。圖1為煎餅發酵面糊中典型酵母菌的生長曲線，0～2 h內5株酵母菌生長較緩慢，菌體需要一定時間來自身的生理機能以適應新環境，此階段為緩慢期；在2～14 h內所有菌株適應新環境后，細胞開始旺盛生長，生長速率達到最大值，菌株進入對數生長期，OD值持續上升，Y8的OD值較大，生長迅速，最大可達2.12。

表3　VITEC-2 compact微生物鑒定儀對酵母菌的鑒定Table 3　VITEC-2 compact microbial identification system for identification of yeasts

2.2菌株的耐pH實驗

對于煎餅發酵劑的選擇不能僅立足于功能特性，要具備適應不同環境的能力。由于煎餅面糊是由酵母菌和乳酸菌共同發酵，發酵過程中乳酸菌會使面糊的pH降低，所以對酵母菌進行耐酸性篩選。圖2為pH對酵母菌的影響，隨pH增加，酵母菌生長迅速，較低pH時，所有酵母菌生長受到抑制，Y8菌株表現出良好的耐受性，故選取Y8作為直投式發酵劑菌株，用于煎餅的連續化生產。

圖2　pH對酵母菌的影響Fig.2　The effect of pH on yeast

2.3VITEC-2 compact微生物鑒定儀對煎餅發酵面糊中酵母菌的鑒定

表3為VITEC-2 compact微生物鑒定儀對酵母菌的鑒定結果。使用濁度儀將酵母菌的菌懸液濁度調為1.96，經過18.25 h的鑒定，鑒定結果為釀酒酵母菌，可能性百分比為97%。

2.4單一保護劑對釀酒酵母菌凍干存活率的影響

若將酵母菌直接進行冷凍干燥，將近93%的菌體直接死亡，因此應選擇能提高菌種冷凍干燥過程存活率的冷凍保護劑。單一保護劑對釀酒酵母菌的保護作用見表4，在沒有添加保護劑時，釀酒酵母菌的存活率只有7.2%，添加保護劑后，釀酒酵母菌的存活率均有不同程度的增加，說明保護劑對釀酒酵母菌具有一定的保護作用。

甘油對酵母菌的保護作用最佳，最大存活率的可達64%，甘油通過與結合水發生水化作用，增加溶液的粘度，可防止冰晶的形成，故提高了釀酒酵母在冷凍干燥過程中的存活率［12］。其次是海藻糖和脫脂乳，其作用效果與王華和曾小群等研究者相似［8，10］。糖類對的保護作用是凍干過程可取代水分子與磷脂雙分子層的極性基團形成氫鍵，防止了磷脂雙分子層的相變，保護了細胞膜的完整性［13］。Lodato等［14］也認為酵母菌處于高溫、脫水、冷凍等環境脅迫條件下，海藻糖對酵母菌具有較好的保護作用。脫脂乳的保護作用是脫脂乳中含有乳糖，同時乳中的膠體物質也提高了玻璃化轉變溫度［15］。甘氨酸對酵母菌的保護作用不明顯。基因位點篩選和基因分析顯示當釀酒酵母菌受到高滲環境脅迫時，細胞內會增強甘油和海藻糖的的代謝，這兩種代謝也被稱為滲透保護劑代謝［16-17］。盡管各保護劑對酵母菌具有一定的保護作用，但保護作用有限，故選用甘油、海藻糖和脫脂乳三種保護劑進行復配實驗，以期得到較好的存活率。

表4　單一保護劑對釀酒酵母菌凍干存活率的影響Table 4　The effect of a single protective agent on survival rate of Saccharomyces cerevisiae

2.5模型的建立及顯著性檢驗

表5列出釀酒酵母菌凍干存活率的實測值及預測值。

利用Design Expert軟件對表5中的數據進行多元回歸分析，得到甘油（X1）、海藻糖（X2）、脫脂乳（X3）的二次回歸方程為：Y=82.40＋1.95X1＋5.26X2－0.24X3－0.65X1X2－0.75X1X3＋0.58X2X3－5.26X12－4.79X22－4.79X32。并對該模型進行方差分析及模型系數顯著性檢驗，見表6、表7。

表5　實驗設計及其結果Table 5　Experimental designs and results

表6　真空冷凍干燥對釀酒酵母菌存活率回歸模型的方差分析結果Table 6　Analysis of variance for regression equation of Saccharomyces cerevisiae survival rate of vacuum freeze-drying

表7　回歸方程系數顯著性檢驗Table 7　Test of significance for regression coefficient of Saccharomyces cerevisiae survival rate of vacuum freeze-drying

由表6方程回歸模型方差分析（ANOVA）可得，F=23.83＞F0.01（9，4）=14.66，p為0.0002，表明模型方程極顯著。失擬項p=0.0562＞0.05，不顯著。模型的校正決定系數（R2adj）為0.9278，說明該模型能解釋92.78%響應值的變化，該方程與實際擬合的較好，能有效反映釀酒酵母菌存活率與甘油、海藻糖、脫脂乳之間的關系，因此所得的方程能預測響應值隨各參數的變化規律。

從表7的回歸方程系數顯著性檢驗可知，一次項中X1（p＜0.05）的偏回歸系數顯著，X2（p＜0.01）的偏回歸系數極顯著，說明甘油和海藻糖對釀酒酵母菌的存活率影響顯著，X3（p＞0.05）的偏回歸系數不顯著，說明脫脂乳對釀酒酵母菌的存活率影響不顯著。交互項的交互作用對存活率影響不顯著。綜合上述分析得知，各因素對響應值的影響程度為X2（海藻糖）＞X1（甘油）＞X3（脫脂乳）。

2.6保護劑對釀酒酵母菌存活率的響應面分析

圖3　甘油、海藻糖及其相互作用對釀酒酵母菌存活率的響應面和等高線圖Fig.3　Response surface plot and its contour plot showing the effects of glycerin，trehalose and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

圖4　甘油、脫脂乳及其相互作用對釀酒酵母菌存活率的響應面和等高線圖Fig.4　Response surface plot and its contour plot showing the effects of glycerin，skim milk and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

圖3～圖5為Design-Expert軟件對回歸方程構建響應面分析圖。圖3為脫脂乳12.5%，甘油和海藻糖對釀酒酵母菌存活率的影響，根據等高線可看出固定海藻糖含量，在甘油3%～4.1%范圍內，釀酒酵母菌的存活率與甘油的用量成正比，在4.1%～5%范圍內，存活率與甘油的用量成反比，固定甘油用量，在1%～1.38%范圍內，釀酒酵母菌存活率與海藻糖用量成正比。圖4為海藻糖1.25%，甘油和脫脂乳對釀酒酵母菌存活率的影響，根據等高線可看出，在甘油含量3%～5%，脫脂乳10%～12.5%時，固定甘油含量，釀酒酵母菌存活率隨脫脂乳含量的增加而增加。圖5為甘油含量4%，海藻糖和脫脂乳對釀酒酵母菌存活率的影響，固定脫脂乳含量，在海藻糖含量1%～1.4%時，釀酒酵母菌存活率隨海藻糖含量的增加而增加，在1.4%～1.5%含量時，釀酒酵母菌存活率隨海藻糖含量的增加而降低。

圖5　海藻糖、脫脂乳及其相互作用對釀酒酵母菌存活率的響應面和等高線圖Fig.5　Response surface plot and its contour plot showing the effects of trehalose，skim milk and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

2.7釀酒酵母菌保護劑最佳配方的確定

在選取的各范圍內，根據回歸模型通過Design Expert軟件分析優化得出，釀酒酵母菌保護劑最佳配方為甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優化條件下，釀酒酵母菌的存活率可83%。為證實實驗結果，用實驗中得到的最佳配方重復實驗3次并取平均值，釀酒酵母菌存活率可達82%，與預測值基本一致，說明該方程與實際情況擬合的較好，充分驗證了模型的正確性。

3　結論

通過發酵面糊中酵母菌的生理及耐受性實驗，Y8酵母菌具有良好的生長特性及耐受性，采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對其鑒定結果為釀酒酵母菌。通過單因素實驗，海藻糖、脫脂乳、甘油三種保護劑對凍干過程釀酒酵母保持活性效果較好；通過響應面法得到復合保護劑配方：甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優化條件下，釀酒酵母菌的存活率可達82%，為煎餅等傳統食品的工業化生產奠定了基礎。

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Identification of yeast in fermented pancake batter and optimization formulations of protection agent

TANG Ming-li，WANG Bo，LIU He，HE Yu-tang，HUI Li-juan，MA Tao*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China）

Yeast strain with local characteristics and naturally fermented pancake flavor were isolated and screened from pancake fermented batter，Y8had rapid growth and strong acid resistance，which was identified by VITEC-2 compact microbial identification system and prepared freeze-dried bacteria ferment whose protective agent was screened and identified.The results showed that yeast of fermented pancake batter was Saccharomyces cerevisiae，optimized formulation of cryoprotectant was glycerin 4.0%，trehalose 1.3%，skim milk 12.7%.Under these conditions，the survival rate of Saccharomyces cerevisiae could reach 82%，the study provided support for continuous and industrial production of traditional foods.

yeast；identification；protective agent；formulation optimization

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0219-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.035

2014－12－05

唐明禮（1988-），男，在讀碩士研究生，研究方向：農產品加工與貯藏，E-mail：707334794@qq.com。

馬濤（1962-），男，教授，研究方向：糧油與植物蛋白工程，E-mail：1040732408@qq.com。