苯丙氨酸解氨酶仿生固定化及其穩定性研究

崔建東，梁龍昊，韓　叢，劉容麟（河北省發酵工程技術研究中心，生物科學與工程學院，河北科技大學，河北石家莊050000）

苯丙氨酸解氨酶仿生固定化及其穩定性研究

崔建東，梁龍昊，韓叢，劉容麟
（河北省發酵工程技術研究中心，生物科學與工程學院，河北科技大學，河北石家莊050000）

利用仿生硅化技術包埋固定化苯丙氨酸解氨酶（PAL），研究固定化條件對PAL固定化的影響及固定化PAL的穩定性。優化的固定化酶制備條件：0.06 mL濃度為6 mg/mL誘導劑聚乙烯亞胺（PEI），25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）作為固定化反應介質體系，2 mL濃度為1 mol/L正硅酸甲酯（TMOS）水解液和1 mL（2 U/mL）酶液添加量，所得固定化酶的酶活最大回收率是70%。與游離酶相比，固定化PAL的溫度穩定性、pH和儲存穩定性，以及變性劑耐受性都有較大提高，重復使用5次，固定化PAL仍能保持初始酶活的40%。

苯丙氨酸解氨酶，仿生硅化，氧化硅，固定化酶，聚乙烯亞胺

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶［1］。存在于各種植物和少數微生物中，PAL可催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，具有廣泛的醫藥和工業應用價值。在醫藥方面主要被用來治療某些腫瘤，還可以診斷和治療苯丙酮尿癥［2］；在生物化工領域被用來酶法生產L-苯丙氨酸。但在應用過程中，該酶表現出較低的酶活和穩定性，限制了其廣泛應用。

仿生礦化技術是近年發展起來的一種新的固定化酶方法。該技術是人們通過模擬自然界某些生物體能夠在常溫下精確控制體內礦物的形成而發展起來的一種技術。與傳統固定化酶方法相比，該技術避免了固定化過程中酸堿催化劑、高速攪拌以及高溫等對酶分子天然活性構象的破壞，有利于酶活保留。且反應條件溫和、快速，目前已經被成功應用在氨基酸氧化酶［3］、脂肪酶［4］、碳酸酐酶［5］等多種酶的固定化中。但關于仿生硅化過程用于PAL固定化方面尚未見報道。

本研究以聚乙烯亞胺為誘導劑，通過模擬仿生硅化過程，將仿生硅化用于PAL的固定化，優化了固定化制備條件，并考察了固定化PAL的催化穩定性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

粘紅酵母（Rhodotorula gluinis）中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC32913）；聚乙烯亞胺（PEI） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；正硅酸甲酯（TMOS）阿拉丁試劑（上海）有限公司；反式肉桂酸阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為市售分析純。

S-4800-Ⅰ型場發射掃描電子顯微鏡日本HITACHI；752型紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司；TGL-16C型離心機上海安亭科學儀器廠；HC-3018型高速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；85-1B磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責任公司；FD-27真空冷凍干燥機北京德天佑科技發展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1PAL的提取將粘紅酵母接于培養基（葡萄糖5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.5 g/L，（NH4）2HPO41 g/L，L-苯丙氨酸0.5 g/L，pH5.5）中，在28℃，150 r/min條件下發酵培養21 h，培養后的粘紅酵母利用微珠渦流法進行細胞破碎提取PAL粗酶液［6］。

1.2.2仿生硅化固定化苯丙氨酸解氨酶取0.152 g TMOS與1 mmol/L鹽酸溶液混合，振蕩10 min，制得濃度為1 mol/L TMOS水解液。取一定量的PAL酶（溶解在25 mmol/L磷酸鹽，pH7.0）與一定量的PEI充分混勻后，加入濃度為1 mol/L TMOS水解液，混合5 min后，混合物經10000×g離心5 min，得到的沉淀物用去離子水洗滌3次，即得固定化PAL。

1.2.3單因素實驗優化固定化PAL制備條件在粗酶液量1 mg/mL、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察TMOS水解液濃度（0.5、0.8、1、1.2、1.5 mmol/L）對固定化PAL酶活回收率的影響；在粗酶液量1 mg/mL、TMOS濃度是1 mmol/L條件下，考察不同PEI濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）對固定化PAL酶活回收率的影響；在TMOS濃度是1 mmol/L、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察粗酶液量（0.2、0.5、0.8、1、1.2 mg/mL）對固定化PAL酶活回收率的影響；在粗酶液量1 mg/mL、TMOS濃度是1 mmol/L、PEI濃度是6 mg/mL條件下，考察不同緩沖液體系（25 mmol/L Tris-HCl，pH7.0，25 mmol/L磷酸鹽，pH7.0或去離子水）對固定化PAL酶活回收率的影響。

1.2.4固定化PAL的形態觀察固定化PAL樣品經真空冷凍干燥后，在真空條件下噴鉑金后利用電子掃描顯微鏡（電子發射電壓60～100 kV）檢測。

1.2.5酶活測定方法以紫外分光光度法測定PAL的酶活［7］。酶促反應液包括0.1 g的酶樣品，2.5 mL 50 mmol/L L-苯丙氨酸和2 mL 25 mmol/L Tris-HCl，pH8.8，在30℃振蕩保溫10 min，然后加入0.2 mL 6 mol/L鹽酸終止反應。10000×g離心5 min，取上清在278 nm下測吸光值。根據反式肉桂酸標準曲線方程：Y= 14.083X-0.5621，R2=0.9999，計算酶活。一個酶活力單位定義為每分鐘催化L-苯丙氨酸生成1 μmol反式肉桂酸的酶量。

1.2.6酶活回收率

1.2.7固定化PAL的穩定性考察對于溫度穩定性，將游離酶和固定化PAL分別置于60℃下處理15、30、45、60 min后，分別檢測酶活。對于pH穩定性，將游離酶和固定化PAL分別置于pH為3、5、7、8和11的緩沖液中處理30 min后，檢測酶活。對于變性劑穩定性，將游離酶和固定化PAL分別置于2%SDS、20%乙醇和6 mol/L尿素中處理15 min，檢測酶活。對于儲存穩定性，將游離酶和固定化PAL分別保存在25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）中，于25℃放置1、5、15、25 d，并在相對應的儲存時間檢測酶活。

1.2.8固定化PAL的重復使用穩定性考察轉化液的配制［8］：740 mg反式肉桂酸溶解到45 mL氨水（0.28 mol/L）中，用硫酸調pH為10，去離子水定容到100 mL。

重復使用穩定性實驗：將固定化PAL與轉化液按照1∶4（v/v）在30℃條件下進行第一輪轉化反應，轉化1 h后，10000×g離心5 min分離出固定化酶，用Tris-HCl（pH8.8）緩沖液洗滌后，在固定化酶中加入新的轉化液進行第二輪轉化，依此分批轉化，每次轉化后分別檢測固定化酶剩余的酶活。直到檢測不到酶活為止。

1.2.9統計分析所有實驗重復進行3次，利用SAS軟件（v8.0）進行統計分析。

2　結果與分析

2.1固定化PAL制備條件優化

2.1.1TMOS水解液濃度對固定化酶的影響從圖1可以得出，TMOS水解液濃度對固定化PAL酶活有顯著影響（p＜0.05），隨著TMOS水解液濃度的增加，固定化酶的酶活回收率增加；在TMOS水解液濃度為1 mol/L時，酶活回收率最高；但隨著TMOS水解液濃度的進一步增加，酶活回收率開始下降。這可能是由于反應體系中PEI的濃度一定，PEI只能催化聚合一定量的TMOS形成氧化硅，對游離酶進行包埋，但當TMOS濃度過大時，剩余的TMOS不能被PEI催化聚合形成氧化硅，導致對PAL的包埋率下降，使酶活回收率降低［4］。

圖1　TMOS水解液濃度對酶活的影響Fig.1　Effect of TMOS concentration on activity

2.1.2PEI濃度對固定化酶的影響由圖2可以看出，隨著PEI濃度增加，固定化酶的酶活也在增加，當PEI濃度達到6 mg/mL時，酶活回收率達到最高，而隨著PEI濃度的繼續增加，酶活開始下降。這可能是由于TMOS硅前體的量一定，PEI只能沉淀一定量的硅膠對酶進行包埋，而過剩的PEI對酶形成靜電屏障，使酶無法與硅前驅體相互吸引，導致包埋效率降低［4］，從而使酶活回收率下降。

圖2　PEI濃度對酶活的影響Fig.2　Effect of PEI concentration on on activity

2.1.3酶量對固定化酶的影響從圖3可知，當PAL酶量小于1 mg/mL時，隨著酶濃度的增加，固定化酶的酶活回收率增加，當酶濃度達到1 mg/mL時，酶活回收率達到最高，達到70%以上。但當酶濃度高于1 mg/mL時，固定化酶的酶活回收率并沒有繼續顯著增加（p＞0.05），反而有所降低。這是由于當酶濃度過高時，多余的酶分子不能被包埋在硅膠中，且酶濃度過高也會使納米級氧化硅載體包埋過量的酶分子，使被包埋的酶分子無法正常伸展形成正確的空間構象［9］，導致固定化酶酶活有所下降。

圖3　酶量對固定化酶酶活的影響Fig.3　Effect of PAL concentration on activity

2.1.4不同緩沖液體系對固定化酶的影響研究表明，仿生硅化過程中，反應介質對誘導形成的仿生氧化硅的形態有較大影響［10］，而氧化硅載體形態又會直接影響固定化酶的最終酶活。結果見圖4，當用磷酸鹽作為反應介質時，固定化酶的酶活回收率最高，而水作為反應介質時固定化酶的酶活回收率最低，可能是由于緩沖液中的陰離子充當了離子交聯劑，促進帶正電的PEI與酶分子通過分子間或分子內靜電作用自組裝形成聚合體，進而為硅前體的縮聚提供模板［10］，使酶分子更多的包埋在硅膠中。

圖4　不同緩沖液對固定化酶酶活的影響Fig.4　Effect of buffer on activity

2.2固定化PAL掃描電鏡形態觀察

圖5是掃描電鏡觀察的固定化PAL的圖片。從圖5中可以看出，在同樣的標尺下（500 nm），當沒有包埋酶分子時，PEI誘導TMOS硅前體所形成的氧化硅顆粒非常小，大致呈微球型，顆粒與顆粒之間團聚的非常致密（圖5A）。而包埋有PAL的固定化酶氧化硅顆粒明顯增加，呈現出較大的球形顆粒，且顆粒之間出現較多空隙（圖5B）。說明在固定化過程中，酶的加入有助于阻止硅前體縮合形成的顆粒進一步相互連接團聚。這種較疏松的結構有利于酶促反應過程中底物和產物的傳遞。

圖5　固定化酶的電鏡圖片（105×）Fig.5　SEM images（105×）

2.3固定化PAL催化穩定性

2.3.1固定化PAL溫度穩定性圖6是固定化PAL的溫度穩定性實驗結果。圖6表明，與游離酶相比，固定化酶具有更高的耐受高溫的能力。在60℃下處理30 min時，游離酶損失了初始酶活的50%以上，而固定化酶僅損失了20%左右的酶活；當處理1 h后，游離酶幾乎喪失了所有酶活，而固定化酶卻還能保留40%以上的酶活。說明當酶分子被包埋在仿生氧化硅中后，酶分子的天然空間構象得以保持［11］，特別是由于有氧化硅的外層保護，溫度的傳遞速度減緩，使高的溫度不能直接作用于酶分子，從而降低了酶的失活率。

圖6　固定化PAL的溫度穩定性Fig.6　Thermostability of encapsulated PAL

2.3.2固定化酶pH穩定性圖7是固定化酶的pH穩定性實驗結果。圖7表明，固定化酶耐受極端pH的能力明顯高于游離酶；游離酶在pH3～8時均有一定的酶活保留率，但固定化酶的酶活保留率要高于游離酶；當趨向于強堿條件時，游離酶酶活損失較大，而固定化酶卻能保留較高的酶活；在pH11的條件下處理30 min，游離酶僅能保留47%的酶活，而固定化酶基本不失活。這可能是由于PAL被包埋在氧化硅載體中后，防止了極端pH條件下大量OH-和H+對酶分子的攻擊，使酶活性中心的結構保持下來，保護酶不失活［12］。

圖7　固定化PAL的pH穩定性Fig.7　pH-stability of encapsulated PAL

2.3.3固定化酶變性劑穩定性圖8是固定化酶對變性劑的穩定性實驗結果。圖8表明，在變性劑作用下，游離酶和固定化酶都有不同程度的失活，但固定化酶表現出對變性劑更高的耐受性。特別是當用2% SDS處理30 min后，游離酶基本失活，只能殘留12%的酶活，但固定化酶還能保留47%的酶活。固定化酶對變性劑的耐受可能是由于游離的酶分子被包埋在仿生氧化硅載體中，氧化硅載體阻礙了變性劑與酶分子的直接接觸，使酶分子的活性結構得以保持，導致酶活被保留下來［4，13］。

圖8　固定化PAL的變性劑穩定性Fig.8　Encapsulated PAL against denaturants

2.3.4固定化酶儲存穩定性固定化酶的儲存穩定性是評價固定化酶應用價值的重要指標［13］。圖9是固定化PAL儲存穩定性實驗結果，在儲存過程中，游離酶和固定化酶酶活都有所下降，但固定化酶儲存穩定性顯著優于游離酶（p＜0.05），在儲存到第25 d時，游離酶已經完全失活，但固定化酶還能保留24%的酶活。說明PAL經過仿生硅化固定化后儲存穩定性有顯著改善，這個結果和張羽飛［14］的研究結果一致。

圖9　固定化PAL的儲存穩定性Fig.9　Storage stability of encapsulated PAL

2.4固定化PAL重復使用性

圖10是固定化酶的重復使用穩定性實驗結果。圖10表明，經過仿生硅化包埋的PAL具有一定的重復使用穩定性，連續重復使用5次后固定化酶仍然能保留近40%的酶活。但是，使用到第7次后，固定化酶基本檢測不到酶活。這可能是由于仿生硅化包埋的PAL的顆粒是納米級的，顆粒較小，在反復離心回收過程中，部分顆粒太小的固定化酶難以回收，導致損失，同時高速離心產生的剪切力也會使固定化酶顆粒被打碎，使酶泄漏，導致酶活損失。

圖10　固定化酶重復使用穩定性Fig.10　Recycling stability of encapsulated PAL

3　結論

本研究首次將溫和的仿生硅化過程用于PAL酶的固定化，固定化的最佳條件是：0.06 mL濃度為6 mg/mL聚乙烯亞胺作為誘導劑，25 mmol/L磷酸鹽（pH7.0）作為固定化的反應介質體系，2 mL濃度為1 mol/L正硅酸甲酯水解液和酶液添加量1 mg/mL（2 U/mL），所得固定化酶的酶活最大回收率是70%。與游離酶相比，固定化酶表現出優越的溫度、pH、變性劑和儲存穩定性，此外，固定化酶還具有一定的重復使用穩定性，在連續重復使用5批次后，固定化酶還能保持初始酶活的近40%。上述結果表明這種固參考文獻

定化酶方法在工業應用中具有較好的實用前景。

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Immobilization of phenylalanine ammonia lyase by biomimetic silica and its stability

CUI Jian-dong，LIANG Long-hao，HAN Cong，LIU Rong-lin
（Research Center for Fermentation Engineering of Hebei，College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050000，China）

In this study，phenylalanine ammonia lyase（PAL）was encapsulated by in polyallylamine-mediated biomimetic silica.The conditions for the preparation of encapsulated PAL were optimized.Moreover，stability of the encapsulated PAL was examined.The optimal activity recovery（70%）of PAL were achieved when 0.06 mL polyallylamine（PEI）of 6 mg/mL，2 mL tetramethoxysilane（TMOS）of 1 mol/L and 1 mL PAL（2 U/mL）in 25 mmol/L phosphate buffer（pH7.0）were used.Compared with free PAL，the encapsulated PAL showed better properties in pH，thermal and storage stabilities，as well as the tolerance abilities against denaturants.In additional，the encapsulated PAL still retained 40%of its initial activity after consecutive 5 cycles.

phenylalanine ammonia lyase；biomimetic silica；monox；Immobilization enzyme；polyethyleneimine

TS202.3

A

1002-0306（2015）18-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.030

2015－01－20

崔建東（1974-），男，博士，教授，研究方向：生物催化與微生物資源開發，E-mail：cjd007cn@163.com。

國家自然科學基金（21072041）；河北省自然科學基金（B2014208054）。