紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中乳酸菌的動態變化

劉春燕，夏　姣，徐　林，王　雙，蒲　彪（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中乳酸菌的動態變化

劉春燕，夏姣，徐林，王雙，蒲彪*
（四川農業大學食品學院，四川雅安625014）

以紅皮蘿卜為原料，用自然發酵法泡漬，研究其發酵過程中各優勢乳酸菌的消長變化規律。從四種培養基中篩選出改良的MC培養基為各類乳酸菌計數培養基，總共得到了七種明顯的菌落形態特征的乳酸菌，將其依次鑒定為乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、食竇魏斯氏（Weissella cibaria）、植物乳桿菌（L.plantarum）、發酵乳桿菌（L.fermentum）。對發酵過程中各種乳酸菌計數，結果顯示：泡蘿卜發酵前期球菌比較旺盛，發酵后期以桿菌為主。泡菜液pH達到3.5后，球菌開始消失。

紅皮蘿卜，發酵，泡菜，乳酸菌，動態變化

泡菜是最常用蔬菜冷加工的一種方法，其利用天然存在于蔬菜表面的微生物共同作用而完成蔬菜的發酵。乳酸菌在泡菜形成過程發揮重要的作用，能利用碳源發酵產生豐富的乳酸，乳酸既能賦予泡菜豐厚的酸味還能起到抑菌作用。

泡菜中乳酸菌的種類很多，主要覆蓋了乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬六個屬的乳酸菌。隨著泡菜發酵的進行，泡菜環境中營養物質及酸度會發生變化，泡菜中乳酸菌種類和數量也不斷變化。Pederson等［1］在1930年首次指出啟動泡卷心菜發酵的菌種為腸膜明串珠菌。鐘之絢［2］、畢金峰等［3］分別分析了酸白菜酸菜汁、泡超級白菜在不同發酵過程中乳酸菌種類及其變化規律。董碩等［4］研究了泡白菜發酵過程中乳球菌屬和乳桿菌屬的動態變化。Jung S L等［5］分析了韓國泡菜發酵過程中的微生物區系，發現Weissella confusa和Leuconostoc citreum存在于整個發酵過程中，Lactobacillus sakei和Lactobacillus curvatus在后期才出現。但目前對于泡菜發酵過程中乳酸菌種類及其數量變化缺乏深入研究。本實驗通過對紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中的乳酸菌進行分離鑒定，分析研究了紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中不同乳酸菌的消長規律，為進一步研究泡紅皮蘿卜中乳酸菌對其風味的影響機理提供一定的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮紅皮蘿卜購于雅安農貿市場；2×PCR Master Mix、離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒北京天根生物科技有限公司；供試用培養基MRS培養基、蔗糖硫胺培養基、M17培養基、改良MC培養基按文獻方法［6-7］配制。

Powerpac Basic電泳儀、MycyclerTMThermal Cycler PCR儀、Universal HoodⅡ凝膠成像系統美國BIORAD公司；YXQ.SG41.280高壓蒸汽滅菌鍋上海華線醫用核子儀器有限公司；CX21S1電子顯微鏡日本OLYMPUS公司；SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺蘇凈安泰空氣技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1泡菜的泡制將紅皮蘿卜清洗、切分（2 cm×2 cm的方塊）、晾干后放入滅菌泡菜壇中，以料液比1∶2加入滅菌水，再添加3.5%（原料+水）食鹽，室溫發酵。

1.2.2培養基的優選取不同發酵期的紅皮蘿卜泡菜液作梯度稀釋，取合適的2～3個稀釋度的稀釋液分別涂布于MRS、蔗糖硫胺、M17、改良MC平板上，30℃恒溫培養2～3 d后觀察菌落形態，并對各種平板上每種菌落形態和菌落總數進行記錄，挑取出現明顯菌落形態、菌落形態種類多、菌落總數多的培養基為實驗用培養基。

1.2.3紅皮蘿卜泡菜發酵過程中不同菌落形態乳酸菌的動態變化以1.2.2中出現菌落形態明顯且菌落形態種類最多的培養基作為實驗用培養基。分別取發酵0～10 d的紅皮蘿卜泡菜液進行乳酸菌動態分析。將泡菜做梯度稀釋后，取2～3個稀釋度的稀釋液涂布于實驗培養基上，30℃恒溫培養2～3 d后觀察計數，每個梯度做兩個平行，計數按照國標［7］進行。

1.2.4pH與可滴定酸的測量pH的測量：用酸度計測量；可滴定酸的測量：按國標GB/T 12456-2008測量［8］。

1.2.5不同菌落形態乳酸菌的鑒定

1.2.5.1乳酸菌的初步鑒定將平板上長的不同形態的菌落每種挑取3～5株劃線純化，進行革蘭氏染色鏡檢觀察，并做過氧化氫酶實驗。將有典型乳酸菌鏡檢形態革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株多次純化后用甘油管保種。生化鑒定方法參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》［6］和《伯杰氏細菌鑒定手冊》第八版［9］，根據菌株的培養形態特征及生理生化特性初步確定其分類地位。

1.2.5.2乳酸菌的分子學鑒定將保種的不同菌落形態的菌株進行活化后（每種形態兩株），用試劑盒提取菌株的總DNA，以27f、1492r為引物對擴增菌株16S rDNA序列。其引物序列：正向引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′［10］。

PCR擴增體系：2×PCRMaster Mix 12.5 μL、引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O補至25 μL。

PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共 30個循環；最后72℃延伸5 min。

PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，目的片段長度在1.5 ku左右。PCR擴增產物送華大基因測序。

1.2.5.3系統發育樹分析將菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank核酸序列數據庫并與數據庫中已知的相關序列進行比較，將相似度高的序列與測定序列通過Clustalx進行多重序列比對，比對結果用MEGA軟件中的Neighbor-Joining法構建系統發育樹［11］。

1.2.6紅皮蘿卜泡菜發酵過程中乳酸菌的動態變化

取不同發酵時期的泡菜液進行乳酸菌動態分析。將泡菜液做梯度稀釋后，取10-2～10-6的稀釋液涂布于實驗培養基上，30℃恒溫培養3 d后觀察菌落形態并對不同的菌落形態菌株分別計數，每個梯度做3個平行，計數方法按照國標方法［7］進行。將不同菌落形態菌株的計數結果結合1.2.5的乳酸菌鑒定結果，將鑒定為同一種屬的不同菌落形態計數結果累加，而得到不同乳酸菌的數量。同時測定不同發酵時期泡菜液的總酸及pH，分析乳酸菌的動態變化。

1.2.7數據處理實驗數據采用Excel和Origin 8.1軟件進行數據處理與分析。

2　結果與分析

2.1培養基的優選

將不同發酵期的紅皮蘿卜泡菜液涂布在MRS、蔗糖硫胺、M17、改良MC平板上，得到的每種平板上的菌落形態種類以及乳酸菌總數分別見表1、圖1。

表1　不同培養基上乳酸菌菌落形態種類Table 1　Morphology of colonies in different medium

圖1　不同培養基上乳酸菌總數的動態變化Fig.1　Dynamic changes of the total number of lactic acid bacteria in different medium

從乳酸菌菌落總數來看，在這四種培養基上，不同發酵期的紅皮蘿卜泡菜液中乳酸菌菌落總數保持在103～109CFU/mL之間，MRS和改良的MC培養基上乳酸菌菌落總數比M17和蔗糖硫胺培養基上偏高。從菌落形態來看，在改良的MC培養基上泡菜乳酸菌形態特征比較明顯，且出現的種類最多。綜合考慮乳酸菌菌落總數和乳酸菌菌落形態特征及種類，選擇改良的MC培養基對紅皮蘿卜發酵過程中的每種優勢乳酸菌進行計數。

2.2改良MC培養基上乳酸菌菌落形態

分別取發酵1～10 d的紅皮蘿卜泡菜水的稀釋液涂布于改良MC平板上，30℃培養3 d后記錄乳酸菌菌落形態和數量，總共得到7種不同菌落形態的乳酸菌，分別命名為MCA-1～MCA-7。挑取改良MC平板上有MCA-1～MCA-7菌落形態的菌株純化劃線，每天的平板上每一類菌落形態的菌挑取3～10株，（每一個平板上挑取菌落總數的平方根株菌劃線純化）純化后的單個菌落革蘭氏染色結果均為陽性，過氧化氫酶陰性，且隨機挑取的同一類菌落形態的不同菌株經過多化后菌落形態保持一致，鏡檢形態也相同，其菌落形態特征及個體形態特征見表2，照片見圖2。

表2　菌落形態特征及細胞形態特征Table 2　Morphology of colonies and morphology of microscopy

圖2　菌落形態特征（上）及細胞形態（下）Fig 2　Morphology of colony（up）and morphology of microscopy（below）

由圖2可知，MCA-1～MCA-7有明顯的菌落形態特征，彼此容易區分，但細胞形態上卻有部分相似點，如MCA-2與MCA-3在菌落形態上差異很大，但細胞形態卻很相似。同時MCA-5與MCA-6在細胞形態上也難以區分。結合各菌株的菌落形態及細胞形態，可得不同菌落形態的菌株其細胞形態可能相同。

2.3不同菌落形態乳酸菌的鑒定

2.3.1生理生化挑取每一種菌落形態的菌株3～5株，多次純化后進行生理生化測試。得到的結果如表3。菌落形態相似的不同菌株其生理生化測試表現一致，此外，從生理生化表現來看，MCA-2與MCA-3應該為同一類球菌，MCA-5、MCA-6可能為同一類桿菌。結合與伯杰氏細菌鑒定手冊，MCA-1和MCA-4菌落形態的菌株可能為明串珠菌屬或魏斯氏菌屬的菌株，MCA-2與MCA-3可能是乳球菌屬，MCA-5、MCA-6為乳桿菌屬中同型發酵的種，MCA-7為乳桿菌屬中異型發酵的種。

2.3.216S rDNA序列測定對分離的不同菌落形態的菌株（每種菌落形態隨機選取兩株）提取DNA，對其16S rDNA序列進行擴增后進行電泳檢測，均得到明顯的目的條帶，電泳檢測圖如下：

圖3　16SrDNA擴增產物電泳結果Fig.3　Elctrophoresis of amplification products of 16S rDNA

利用BLAST軟件，將14株乳酸菌的16SrDNA/rRNA序列與GenBank中已知乳酸菌的相應序列進行比較，比較后可知，3-1-1、2-1-1兩株菌與Leuconostoc lactis NBRC 102477的同源性均在99%以上，從分子水平上可將這兩株歸屬為Leuconostoc lactis；而2-2-3，3-2-1，3-3-2，2-3-1與Lactococcus lactis CICC 6025的同源性在99%以上，而可將該四株菌認定為Lactococcus lactis，MCA-2、MCA-3可能為Lactococcus lactis兩種不同表型；1-4-1與4-4-1則同Weissella cibaria NRIC 0136有較高的同源性，達到100%；3-5-3，8-5-2，3-6-1，9-6-1則與Lactobacillus plantarumNBRC 101977的同源性達到99%以上，則MCA-5與MCA-6為Lactobacillus plantarum的兩種不同表型；3-7-2和6-7-1和Lactobacillus fermentum NBRC 3961同源性為100%，被判定為Lactobacillus fermentum。且同一菌落形態的兩株不同菌株均屬于同一乳酸菌種群，因而可以將這14株菌和5株相應模式菌株的16S rDNA序列構建了系統發育樹，結果見圖4。從系統發育樹上可看出：七種不同菌落形態的菌株總體可分為5個大群，依次為Leuconostoc lactis、Lactococcus lactis、Weissella cibaria、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus plantarum類群，且在改良MC培養基上有不同菌落形態的菌株其在分子分類上可能為同一類。

表3　菌株生理生化特性Table 3　Physico-chemical characteristics

圖4　16S rDNA系統發育樹Fig.4　Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences

2.4泡蘿卜發酵過程中乳酸菌的動態變化

泡蘿卜發酵過程中總酸、pH、乳酸菌的動態變化如圖5、圖6。

圖5　泡蘿卜發酵過程總酸、pH動態變化Fig.5　Daynamic changes of total acid and pH during the fermentation of pickled red radish

由圖5可知，泡蘿卜自然發酵過程，總酸先隨時間的增加而顯著增加，當總酸含量達到7.0 g/kg時趨于穩定，且泡蘿卜和泡菜液中總酸含量基本一致；pH隨發酵的進行而明顯降低，pH達到3.5后趨于穩定，最后保持在3.0左右。

由圖6可以看出，泡蘿卜發酵過程中，Leuconostoc lactis、Lactococcus lactis、Weissella cibaria三種菌在泡菜水中活躍早，存活時間較短，該三種菌在發酵的第3 d出現消減趨勢，分別在發酵第4、5、6 d完全消失，在泡菜水中的最大檢出量依次為6.2、8.0、7.1 log CFU/mL；L.fermentum、L.plantarum在泡菜水中出現的時間稍晚，但存活時間長。植物乳桿菌在泡菜發酵第3 d后數量基本保持在7.0～8.0 log CFU/mL，發酵乳桿菌在發酵第3 d數量達到最大值（7.0 log CFU/mL）后逐漸減少，到發酵的第7 d后保持在5.0 log CFU/mL。在整個發酵過程中，乳酸菌總數的從第1 d后基本穩定，保持在8.0 log CFU/mL左右。

結合泡蘿卜發酵過程中乳酸菌、pH、總酸的變化可得：在總酸＜2 g/kg時（pH＞3.8），泡菜水中的乳酸菌以Leuconostoc lactis、Lactococcus lactis、Weissella cibaria為主體；2 g/kg＜總酸＜5.5 g/kg時（3.3＜pH＜3.8），Leuconostoc lactis、Lactococcus lactis、Weissella cibaria、L.fermentum、L.plantarum共存；5.5 g/kg＜總酸時（pH＜3.3），L.fermentum、L.plantarum為主體。

圖6　泡蘿卜發酵過程中乳酸菌的動態變化Fig.6　Daynamic changes of lactic acid bacteria during the fermentation of pickled radish

3　討論

泡菜中活動的乳酸菌種類與泡菜產地、原料種類、發酵方式有關。不同學者由于采用的研究方法及原料不一樣，得到的結果也不盡相同。陳功等［12］研究了四川泡菜乳酸菌多樣性，發現L.plantarum、Pediococcus ethanolidurans、L.brevis、Leuconostoc mesentroides等是四川泡菜發酵的優勢菌群。談重芳等［13］報道了河南林州泡菜中的L.plantarum、L.brevis、L.pentosus、L.fermentum、L.collinoides、Lactobacillus buchneri、Leuconostoc mesentroides，且乳桿菌為優勢菌，燕平梅等［14］也有相似的報道。Jie Yu等［15］從泡菜中分離到了Pediococcus ethanolidurans和Leuconostoc lactis，Ayaka IuChi等［16］從日本泡菜nuka-zuke分離到Pediococcus ethanolidurans和Leuconostoc lactis，Yisheng Chen等［17］從發酵黃瓜中分離到了Leuconostoc lactis和Weissella cibaria。國內對泡菜中乳桿菌報道居多，關于Leuconostoc lactis、Weissella cibaria的報道很少。本次實驗從泡菜中分離到了Leuconostoc lactis、Lactococcus lactis、Weissella cibaria、L.plantarum、L.fermentum.五種乳酸菌，豐富了國內泡菜中乳酸菌種類報道。但同時未檢到常見報道的L.brevis、L.pentosus、Leuconostoc mesentroides，其可能與采用的泡菜原料相關，也有可能是這幾種菌在改良MC上的形態與其他菌種相似性太高，且在數量上不占優勢相關。

在泡菜自然發酵過程中，隨著發酵的進行，泡菜內環境會發生不斷變化，不同乳酸菌在泡菜液中的活躍期隨其對內環境的耐受性不同而不同。在發酵初期，在鹽水的高滲透作用下，蔬菜中的可溶性物質進入泡菜液中，為微生物的生長提供了營養物質，此時，存在于原料上的優勢菌屬如明串珠菌及乳球菌等快速繁殖。在發酵的第0 d，蘿卜泡菜液中只檢測到Lactococcus lactis和Weissella cibaria，這說明在原料表面的Lactococcus lactis和Weissella cibaria要遠遠多于其他乳酸菌。在發酵第1 d，泡菜液中Lactococcus lactis和Weissella cibaria很活躍，數量分別達到7.9、7.1 log CFU/mL，同時Leuconostoc lactis也被檢測出來，數量達到5.2 log CFU/mL，這些乳酸菌快速繁殖會產生大量乳酸等酸性代謝產物，而使pH降低。低pH不僅能抑制有害菌的生長，還會抑制乳酸菌本身的生長。Lactococcus lactis、Weissella cibaria、Leuconostoc lactis在泡菜液中消失的時間的先后與自身耐低pH有關。三者的耐pH能力：Leuconostoc lactis＜Lactococcus lactis＜Weissella cibaria，在泡菜液pH達到3.5時，三者數量明顯減少，且分別在第4、5、6 d消失。Lactococcus lactis、Weissella cibaria，Leuconostoc lactis在泡菜發酵前期能保持優勢，還跟這三種菌本身的生長周期有關。Sang Hyeon Jeong等［18］研究發現在韓國泡菜發酵過程中，Leuconostoc citreum，Leuconostoc holzapfelii，Lactococcus lactis和Weissella soli在前期比較活躍，隨后又被L.sakei，Leuconostoc gasicomitatum和Weissella koreensis代替。乳桿菌在發酵的第2 d被檢出，L. fermentum在第3 d達到最高峰后逐漸減少最后保持穩定，L.plantarum從發酵第3 d（pH3.5）開始，在數量上居主導地位，保持在7～8 log CFU/mL。L.fermentum和L.plantarum能穩定生長于泡菜水中，與他們有較強的耐酸性相關。

有學者［19］研究了泡卷心菜中乳酸菌的動態變化，發現泡卷心菜中的優勢菌一開始為Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides，然后為E.faecalis and L.lactis subsp.lactis、L.zeae，最后L.plantarum和L.casei占主體。與本文的研究在優勢菌種類上有差異，由于自然發酵泡菜中的乳酸菌主要來自原料，這可能說明不同地方的不同蔬菜原料附帶的乳酸菌種類不一樣。陳功等［12］研究了四川泡菜中乳酸菌的多樣性，發現四川泡菜主要包括植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、短乳桿菌、發酵乳桿菌、乳酸乳球菌、清酒乳桿菌等，沒有覆蓋本文分離到的乳明串珠菌及魏斯氏菌屬，可能是因為這兩種菌在泡菜中存活的時間比較短，而大部分研究只是針對發酵成熟的泡菜進行的。

實驗研究結果和一些學者的研究結果在動態上有相同點，在菌種類上有差異：如Tao Xiong等［19］研究了酸菜發酵過程中乳酸菌的消長規律，發現Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroid啟動整個發酵過程，隨后是E.faecal，Lactococcus 1actis subsp.Lacti，L.zeae出現并參與發酵，最終L.plantarum和L.casei終止發酵過程；Ji Young Jung等［20］發現Leuconostoc Mesenteroides是韓國泡菜發酵前期最活躍的乳酸菌，隨后變成L.sakei和W.koreensis，且L.sakei在發酵的第25 d消失。這些在整體上都證明了乳球菌、明串珠菌在泡菜發酵前期活躍，乳桿菌在泡菜發酵中后期較活躍。

4　結論

實驗篩選出改良的MC培養基為優良的各類乳酸菌計數培養基，同時從紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中共分離得到了五種乳酸菌，分別為乳明串珠菌（Leuconostoclactis）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、食竇魏斯氏（Weissella cibaria）、植物乳桿菌（L.plantarum）、發酵乳桿菌（L.fermentum）。紅皮蘿卜泡菜自然發酵過程中前期的優勢菌為Lactococcus lactis、Weissella cibaria、Leuconostoc lactis，中后期為L.fermentum和L.plantarum，前期優勢菌耐酸力弱于中后期優勢菌。

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Dynamic changes of lactic acid bacteria flora during the fermentation of red radish pickle

LIU Chun-yan，XIA Jiao，XU Lin，WANG Shuang，PU Biao*
（College of Food，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

A red radish as materials by spontaneous fermentation making Sichuan pickle in this paper.The dynamic changes of lactic acid bacteria flora during the fermentation period were studied.MC was isolated as lactic acid bacteria counting substrate from 4 substrates，and there were 7 obvious floras characteristics lactic acid bacteria on it，which identified as Leuconostoc lactis，Lactococcus lactis，Weissella cibaria，L.plantarum，L.fermentum.The results showed that，coccus predominated in the early stage of fermentation in radish pickle，while Bacillus were the mainly lactic acid bacteria during final stage of fermentation.After the pH of pickle reached to 3.5，the coccus began to disappearing.

red radish；fermentation；pickle；lactic acid bacteria；dynamic change

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.027

2014－12－22

劉春燕（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向；果蔬加工理論與技術，E-mail：chunyanliu1989@126.com.。

蒲彪（1956-），男，博士，教授，研究方向：果蔬加工、功能性食品，E-mail：pubiao2002@163.com。

“十二五”國家科技支撐項目（2012BAD31B04）；國家自然科學基金資助項目（31171726）；四川省科技支撐計劃項目（2012NZ0002）。