重組魚腥藻脂肪氧合酶定點突變及突變酶酶學性質研究

刁含文，張　充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新（南京農業大學食品科學與技術學院，江蘇南京210095）

重組魚腥藻脂肪氧合酶定點突變及突變酶酶學性質研究

刁含文，張充，呂鳳霞，別小妹，陸兆新*
（南京農業大學食品科學與技術學院，江蘇南京210095）

重組魚腥藻脂肪氧合酶（Ana-LOX）基因來自于Anabaena sp.PCC 7120。利用定點突變技術將Ana-LOX的421位和40位的纈氨酸（Val）突變為丙氨酸（Ala），獲得突變體V421A、V40A和V421A/V40A。野生型Ana-LOX在50℃下半衰期為3.8 min。而突變酶V421A和V40A在50℃的半衰期分別為4.4 min和7.0 min。突變酶V421A/V40A的半衰期為8.3 min，與野生型Ana-LOX相比，提高了1.18倍。相對于野生酶，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的比活力分別提高了4.83%、41.58%、80.07%。突變酶的最適反應溫度均比野生酶（35℃）高5℃。改造后的突變酶更能適合工業生產的需要，對于實際應用具有重要價值。

脂肪氧合酶，定點突變，酶學性質

脂肪氧合酶（Lipoxygenase，EC1.13.11.12，LOX）是一類含有非血紅素鐵的蛋白，能夠催化具有順，順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸的雙加氧反應［1］，形成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物。LOX在食品工業、醫藥工業［2］和化工領域［3-4］，具有廣泛的應用。食品方面，LOX能夠將面粉中的不飽和脂肪酸催化氧化成相應的氫過氧化物。這些氫過氧化物能夠破壞β-胡蘿卜素的雙鍵結構，并且能夠將面粉蛋白中的巰基（-SH）氧化成為二硫鍵（-S-S-），從而起到提高面粉白度，增強面筋蛋白的強度的作用［5］；化工方面，LOX早已被用于造紙業［3］和紡織工業［4］的脫色，市場需求巨大。脂肪氧合酶廣泛存在于植物、動物［6-7］中，在微生物中鮮有發現。近年來，Anabaena sp.PCC 7120已被證實為能夠生產脂肪氧合酶的微生物［2，8-9］。但是Ana-LOX的熱穩定性較差，無法直接用于工業生產中。因此，為了使Ana-LOX獲得更為廣泛的工業應用，提高Ana-LOX的熱穩定性是非常必要的。本實驗室張充等［10］已成功對Anabaena sp.PCC 7120 LOX（Ana-LOX）基因進行克隆表達，但是未對其性質進行改造。

定點突變常作為用于提高酶分子催化特性的策略［11-12］。Wennman等［13］通過定點突變替換Gly332，Leu336和Phe337單個氨基酸研究錳型脂肪氧合酶和鐵型脂肪氧合酶的催化特性。通過序列比對和同源建模，獲得合適的目標位點，再對這些位點進行定點突變以提高酶分子熱穩定性［14-15］。這種基于理性設計的方法相較隨機突變等非理性設計方法更加方便、高效和可行［16］。目前國內外未有關于定點突變提高Anabaena sp.PCC 7120的重組魚腥藻脂肪氧合酶熱穩定性和酶活的報道，本研究對來源于Anabaena sp. PCC 7120的重組魚腥藻脂肪氧合酶進行定點突變，提高了其熱穩定性和酶活，拓展重組魚腥藻脂肪氧合酶在工業方面的應用前景。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

具有編碼魚腥藻（Anabaena sp.PCC 7120）脂肪氧合酶基因的表達載體pET-32a（+）/Ana-LOX由本實驗室構建［2］；Escherichia coli DH5α（△LacU169（Φ80 LacZ△M15）克隆宿主、E.coli BL21（DE3）pLysS（F-ompT hsdSB（rB-mB-）gal dcm（DE3）pLysS Camr） 為本實驗室保藏；DNA Marker、IPTG購自TaKaRa公司；氨芐青霉素購自Amresco；瓊脂糖、胰蛋白胨和酵母粉為Oxoid公司生產；其他常規試劑均為分析純；突變試劑盒（Fast Mutagenesis Kit and Taq Master Mix）購自諾唯贊Vazyme（Nanjing，China）；DNA凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）、質粒提取試劑盒（Bacterial DNA Kit）購自OMEGA（Shanghai，China）；LB培養基胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，用5 mol/L NaOH將pH調到7.0。加水定容到1000mL。配制固體培養基時，按每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

SWCJ1FD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；培英HYLA全溫搖瓶柜太倉實驗設備廠；UV2600紫外可見分光光度計日本島津公司；5804 R高速冷凍離心機Eppendorf德國基因公司；EPs6o4穩壓水平電泳儀南京科寶儀器公司；手提式蒸汽壓力滅菌器上海醫用核子儀器廠；PTC100TM PCR儀MJ Research公司；JC380c全自動數碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司；JY91ⅡDN超聲波破碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1Ana-LOX基因多序列比對和同源建模將Ana-LOX基因序列經BLAST（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST.cgi）與GenBank中的非冗余蛋白數據庫進行同源性比對，選擇相似性較高的基因序列以作為同源建模的模板。再利用Swiss-Model軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）［17］進行同源建模，預測重組Ana-LOX的三維結構，采用Rasmol對其三維結構進行進一步分析以獲得合適的突變位點。

1.2.2Ana-LOX基因的定點突變通過以上多序列比對和同源建模分析，我們選擇421位點和40位點作為定點突變靶位點。利用定點突變試劑盒（Mut Express II Fast Mutagenesis Kit）獲得突變型脂肪氧合酶重組表達載體。根據其使用說明書，對野生型脂肪氧合酶重組表達載體pET-32a（+）/Ana-LOX的DNA進行擴增，獲得線性形式的重組表達載體DNA，再利用同源重組酶進行環化獲得完整的突變型脂肪氧合酶重組表達載體。所有突變基因都送至Invitrogen Life Technologies（Shanghai，China）基因序列測序驗證，通過測序驗證后，將正確突變的重組表達載體轉化入E.coli BL21（DE3）進行蛋白表達。用于定點突變的引物如下：V421A-f：TACAACTCAgctGCAGTATATG GATCGGATTTACTCAAACA；V421A-r：ATATACTGC agcTGAGTTGTATCGAATTGATGAAAGTACCC；V40A-f：CCCTCTCCCAgcgACTGAAATTCCTTCTAAAAGATT CC；V40A-r：GAATTTCAGTcgcTGGGAGAGGGAAAT AAACTGGTTTTC。

如上所示，我們利用兩對寡核苷酸引物進行定點突變獲得了兩個重要的突變體（V421A和V40A）。

1.2.3重組脂肪氧合酶的誘導表達分別挑取含有重組表達載體的野生菌和突變菌E.coli BL21（DE3）接種于20 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、180 r/min搖床培養12 h獲得種子液。分別取100 μL種子液接種于100 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、180 r/min搖床培養至發酵液菌體濃度達到OD600=0.6時，加IPTG至100 μg/mL，16℃、180 r/min進行低溫誘導表達16 h。4℃、9000 r/min離心5 min，收集菌體。

1.2.4重組脂肪氧合酶的分離純化將誘導表達收集到的菌體，用磷酸緩沖液（50 mmol/L PBS+0.3 mol/L NaCl+0.5%Triton X-100）重懸菌體，超聲波破碎菌體（400 W，超聲5 s，間歇10 s，共超聲15 min），4℃、9000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液［10］。將處理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑（50、100、150、200 mmol/L）的洗脫液洗脫Ni-NTA柱，收集洗脫峰，測定相應的酶活。

1.2.5SDS-PAGE分析SDS-PAGE電泳參照Lorenzi等［6］報道的方法，將純化前后的野生型和突變型Ana-LOX進行SDS-PAGE電泳（SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為10%，膠厚1.0 mm。電泳完畢后，取出凝膠，固定、考馬斯亮藍R-250染色、脫色后觀察并拍照。

1.2.6重組脂肪氧合酶酶活測定脂肪氧合酶活性分析用亞油酸鈉作為底物。酶反應體系中含有：pH9.0的Tris-HCl緩沖液2.79 mL，酶液10 μL，亞油酸鈉200 μL，混勻后放入35℃水浴中并開始計時，反應3 min后測定吸光度［18］。酶活單位定義：在上述條件下以1 min內3 mL反應體系在234 nm的吸光度增加0.001作為一個酶活力單位U［19］。

1.2.7重組脂肪氧合酶酶學性質研究重組脂肪氧合酶的最適反應溫度：將緩沖液分別在25、30、35、40、45、50、55、65℃水浴中保溫10 min，加入10 μL待測酶液，在不同溫度下反應3 min，在234 nm下測定吸光值，以不加酶的溶液作對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標作圖，得到該酶的最適反應溫度。

重組脂肪氧合酶的半衰期：將待測酶液分別在50℃的水浴中保溫，每隔5 min取出一組樣品，迅速置于冰水中，待保溫結束后統一進行酶活力測定，以未處理酶液做為對照。以溫度為橫坐標，酶活力為縱坐標，得到溫度對酶活力的影響曲線。

重組脂肪氧合酶的最適pH：以亞油酸鈉為底物，分別用濃度為50 mmol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉（pH4～6）、磷酸鹽（pH6～8）、Tris-HCl（pH7.5～9）、硼酸/硼酸鈉（pH8～11）的緩沖液作為Ana-LOX催化反應的條件，按酶活力測定方法中所述，進行酶活測定。

表觀動力學參數（Km和kcat）：以0.15 mol/L Tri-HCl Buffer（pH9.0）為緩沖液，以濃度梯度為0.01、0.015、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125 mmol/L的亞油酸為底物，進行酶活測定。所有測定重復三次，利用獲得的數據繪制雙倒數曲線圖對動力學參數進行評估。

2　結果與分析

2.1定點突變和突變體表達

根據多序列比對和同源建模，選取421位點和40位點作為突變位點。通過定點突變利用丙氨酸（Ala）替換重組表達載體上野生型Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸（Val），獲得了突變體V421A和V40A。而突變體V421A/V40A是以pET-32a（+）/Ana-LOX-V421A為模板，利用V40A的引物進行定點突變獲得的。將突變型Ana-LOX重組表達載體轉入E.coli BL21大腸桿菌工程菌，對野生型和突變型脂肪氧合酶進行相同條件下的發酵表達。

2.2重組Ana-LOX分離純化

利用Ni-NTA His Tag Kit對重組Ana-LOX進行分離純化。如圖1所示，對純化前后野生型和突變型重組Ana-LOX進行SDS-PAGE檢測，SDS-PAGE分析顯示所有的重組Ana-LOX（左）均能被E.coli表達系統分泌表達，而且分泌表達的重組Ana-LOX經純化后（右）條帶單一，結果顯示純化效果較好。

圖1　SDS-PAGE電泳分析純化前后野生型和突變型Ana-LOXFig.1　SDS-PAGE analysis for unpurified and purified wildtype Ana-LOX and mutants

2.3野生型和突變型Ana-LOX活力測定

經過對野生型和突變型Ana-LOX發酵表達和活力測定，突變體V40A，V421A以及它們的組合體V421A/V40A均表現出比野生型Ana-LOX更高的比活力。值得注意的是，突變體V40A和V421A的比活力相對于野生型Ana-LOX分別提高了4.83%和41.58%。而其組合體V421A/V40A的比活力提高80.07%（圖2，表1），分析可知組合體V421A/V40A是對突變體V40A和V421A的優勢組合，產生了協同作用。以上結果顯示用丙氨酸（Ala）替換重組Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸（Val）能夠提高重組Ana-LOX的比活力。

圖2　野生型和突變型Ana-LOX相對酶活Fig.2　Comparative activity of the wild-type Ana-LOX and the mutant enzymes

2.4重組Ana-LOX的性質研究

2.4.1重組脂肪氧合酶的最適反應溫度將純化后的重組酶在不同的溫度條件下，以相同的酶蛋白濃度和底物濃度的作為反應體系進行反應，測定各條件下的活力。結果表明野生型重組脂肪氧合酶的最適反應溫度為35℃（圖3）。而突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的最適反應溫度均較野生酶提高了5℃，達到40℃。觀察圖3，還可以發現20～55℃溫度區間里，突變酶V421A、V40A和V421A/V40A的相對酶活均高于野生酶。

圖3　野生型和突變型Ana-LOX最適反應溫度Fig.3　Optimal reaction temperatures of the wild-type Ana-LOX and the V2，V7 and V mutants

2.4.2重組脂肪氧合酶的熱穩定性對重組Ana-LOX的熱穩定性進行了研究。如圖4和表1所示，野生酶在50℃下的半衰期（T1/2）為3.8 min。而突變酶V421A和V40A的T1/2分別為4.4 min和7.0 min。他們的優勢組合體V421A/V40A的T1/2則達到了8.3 min，顯示出組合體V421A/V40A除了在活力方面具有協同作用外，在熱穩定性方面也存在著優勢累加的協同作用。以上結果表明用Ala替換重組Ana-LOX基因中421位點和40位點的纈氨酸Val能夠提高重組Ana-LOX的熱穩定性。

2.4.3重組脂肪氧合酶的最適pH將純化的重組酶在不同的pH條件下，以相同的酶蛋白濃度和底物濃度的作為反應體系進行反應，測定各條件下的活力。不同pH對重組脂肪氧合酶活力的影響。如圖5所示，野生型和突變型重組脂肪氧合酶的最適反應pH均為9。

圖4　野生型和突變型Ana-LOX 50℃下半衰期Fig.4　The half-life（T1/2）of the wild-type Ana-LOX and the V2，V7 and V mutants at 50℃

2.4.4重組脂肪氧合酶的動力學分析野生型和突變型脂肪氧合酶的催化特性，通過測定不同底物濃度下的反應速率獲得。如表1所知，突變酶V421A/V40A的Km相對野生酶顯著降低，而突變酶V421A和V40A沒有顯著的變化。酶分子的Km越低，其與底物的親和力越高，因此突變酶V421A/V40A相對野生酶與底物更具有親和力。kcat與Km的比值（kcat/Km）表示酶分子的催化效率，如表1所示，重組Ana-LOX的催化效率與其比活力有著相同的變化趨勢。突變酶的催化速率（kcat）均高于野生酶，并且突變體V421A具有最高的催化速率，達到了野生型的1.65倍。

表1　野生型和突變型Ana-LOX的酶學性質Table 1　Enzymatic properties of the wild-type LOX and the mutants

2.5突變位點結構分析

通過多序列對比對Ana-LOX基因序列進行同源性分析。利用Swiss-Model，以來自Pseudomonas aeruginosa的脂肪氧合酶三維結構（PDB：4g33）［20］為模板，進行同源建模。通過觀察分析Ana-LOX預測的三維結構發現，421位的纈氨酸位于某段α螺旋中（圖6），而40位的纈氨酸位于酶分子表面的氮末端的Loop環中。本研究以Ana-LOX基因序列中421位點和40位點作為突變靶位點。利用定點突變將421位點和40位點的Val替換為Ala，獲得突變體V421A、V40A和V421A/ V40A。再次利用Swiss-Model對突變體進行同源建模，獲得突變體的模擬三維結構。

圖5　野生型和突變型Ana-LOX最適pHFig.5　Optimal reaction pH of the wild-type Ana-LOX and the mutant enzymes

實驗發現，氨基酸替換后的突變體在熱穩定性和酶活方面均有所提高。一方面，通過穩定α螺旋來實現的。研究證實，具有較大β側鏈的氨基酸（如Val，Ile，Thr）不利于α螺旋的穩定［21］。而與纈氨酸相比，丙氨酸具有較小的β側鏈，并且丙氨酸比纈氨酸更具有形成α螺旋的傾向［22］。圖5（A）的Ana-LOX三維結構所示，421位的纈氨酸破壞了V421所處的整個α螺旋的完整性。因此利用Ala替換掉α螺旋中β側鏈較大的纈氨酸提高了Ana-LOX酶分子的穩定性。另外值得注意的是，在突變體V421A的三維結構中，在55位到70位形成了一段新的α螺旋（圖6B）。由于具有較大β側鏈的纈氨酸在421位處所占的空間位置較大，迫使420位的絲氨酸向外擴展，因此妨礙了55位到70位α螺旋的形成。因此突變體V421A為421位相鄰的側鏈形成α螺旋提供了一定的空間，同時也為Ana-LOX酶分子生成了一個新的穩定的二級結構。因為比那些松散無序的結構更能夠穩定蛋白質。作為結果，突變體V421A在熱穩定性和比活力方面均有所提高。

圖6　Ana-LOX 421位氨基酸突變前后三維結構模擬圖Fig.6　Three-dimensional homology model of Ana-LOX before（A）and after（B）substitution

另一方面，有研究報道降低蛋白表面與溶劑接觸的氨基酸的疏水性，是穩定蛋白質的一個有效策略［23-24］。纈氨酸和丙氨酸都是非極性氨基酸，但是，丙氨酸是所有非極性氨基酸中疏水性最小的。因此利用定點突變將40位的纈氨酸替換為丙氨酸，降低了Ana-LOX表面氨基酸的疏水性，最終提高了Ana-LOX的熱穩定性。

3　結論

分別通過以上兩種策略將位點421和40上的纈氨酸突變為丙氨酸提高了Ana-LOX的熱穩定性和活力。而優勢組合突變體V421A/V40A將這兩種策略同時結合，達到協同提高的作用。本研究通過定點突變對重組魚腥藻脂肪氧合酶進行改造，提高了重組脂肪氧合酶的熱穩定性和酶活。為脂肪氧合酶廣泛的工業應用，提供更多可行性。尤其是在食品工業，同時有關Ana-LOX食品級應用是我們進一步研究的重點方向。

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Site-directed mutagenesis of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 and enzymatic properties of the mutants

DIAO Han-wen，ZHANG Chong，LV Feng-xia，BIE Xiao-mei，LU Zhao-xin*
（College of Food Science and Technology，Nanjing Agriculture university，Nanjing 210095，China）

The thermostability and specific activity of lipoxygenase（Ana-LOX）from Anabaena sp.PCC 7120 were improved with replacing valine with alanine by site-directed mutagenesis.Compared to the wild-type enzyme which had a half-life（T1/2）of inactivation of 3.8 min at 50℃，the T1/2of mutant enzymes with V421A and V40A substitution increased to 4.4 and 7.0 min，respectively.The double mutant V421A/V40A showed a synergistic effect with a T1/2value of 8.3 min，resulting in a 1.18-fold improvement compared to the original Ana-LOX. V421A，V40A and V421A/V40A also obtained 4.83%，41.58%and 80.07%increase in specific activity，respectively. And，the mutant enzymes obtained 5℃ increase in optimum temperature than the wild-type enzyme（35℃）. This study provided useful theoretical reference for enzyme molecular modification and application in vitro.

lipoxygenase；site-directed mutagenesis；enzymatic properties

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.024

2015－01－08

刁含文（1990-），男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：2012108038@njau.edu.cn。

陸兆新（1957-），男，教授，研究方向：食品生物技術，E-mail：fmb@njau.edu.cn。

國家自然科學基金項目（31470095；31201423）；國家863計劃（2012AA022207）；江蘇省科技支撐計劃（BE2011390）。