豬β2腎上腺素受體基因克隆及重組酵母表達質粒的構建

王　　健，李永飛，佘永新，金茂俊，王　　靜，*（.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京0008；2.河北北方學院食品科學系，河北張家口075000）

豬β2腎上腺素受體基因克隆及重組酵母表達質粒的構建

王健1，2，李永飛1，佘永新1，金茂俊1，王靜1，*
（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京100081；2.河北北方學院食品科學系，河北張家口075000）

克隆豬β2AR基因并進行序列分析，構建其重組酵母表達質粒。采集新鮮豬肝組織，提取總RNA，經RT-PCR擴增、克隆及鑒定，獲得豬β2AR的cDNA序列，并對該序列及編碼的氨基酸序列進行分析。同時將目的基因插入pPICZα A酵母表達載體，構建重組表達質粒。克隆獲得豬β2AR基因cDNA序列1257 bp，Genbank登錄號為KF023571.1，編碼418個氨基酸，蛋白分子質量46.73 ku。生物信息學分析表明，該基因與其他物種的β2AR基因相似性較高，均在83%以上，具有較高的同源性。經PCR和雙酶切鑒定以及測序分析，證明成功構建了重組酵母表達質粒pPICZαA-β2AR。本研究為豬β2AR基因在畢赤酵母系統的表達及建立基于受體的β激動劑多殘留檢測方法奠定了基礎。

β2腎上腺素受體，克隆，酵母表達質粒，豬

目前，β激動劑的違禁添加是影響我國動物源食品安全和畜牧業健康發展的焦點問題之一。特別是多種β激動劑的混合添加及新型結構類似物的的不斷涌現，給此類違禁物的有效監管帶來巨大挑戰。主要原因是現行的快速檢測技術如ELISA［1-3］、膠體金試紙條［4］和生物傳感器［5-7］等均不能很好的解決β激動劑的多殘留檢測和未知物篩查。基于重組受體的β激動劑檢測方法，是利用β2AR受體與β激動劑的類特異性吸附原理建立檢測體系，開辟了一條針對該類違禁物的多殘留檢測及未知物篩查的新途徑。

獲得大量高純度、活性好的β2AR蛋白是建立β激動劑受體分析法的基礎，也是該技術在研發應用方面遇到的最大瓶頸之一。β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）是能夠被腎上腺素激活的一類G蛋白偶聯受體（GPCR），具有7次跨膜α螺旋結構［8］，給它的體外表達和純化帶來很大麻煩。1986年，Dixon等［9］采用HPLC及親和層析的方法首次純化得到β2AR，即倉鼠肺β2AR。Liang W等［10］于1997年首次克隆得到了完整的豬β2AR基因，并對其基因及氨基酸序列進行了分析。目前，β2AR已在大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物等多種表達系統中成功表達出了有活性的受體蛋白。但國外主要側重研究該受體的晶體結構和功能［11-12］、受體配體間的相互作用［13-14］等方面，將其用于β激動劑檢測方面的報道還十分罕見。國內仍處于對該受體的表達、純化等的初步研究階段。宋榮［15］克隆得到大倉鼠β2AR基因，并進行了原核表達和畢赤酵母表達質粒構建；王迪［16］利用大腸桿菌和哺乳動物細胞上表達的β2AR蛋白進行了酶受體分析法的初步嘗試。到目前為止，還未有利用克隆得到的豬β2AR基因構建重組酵母表達質粒的相關報道，本研究旨為豬β2AR基因在畢赤酵母的體外表達及在β激動劑快速檢測中的應用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

DH5α感受態大腸桿菌北京全式金生物技術有限公司；TA克隆載體pMD-18TTaKaRa；pPICZα A酵母表達載體由北京勤邦生物技術有限公司惠贈；總RNA提取試劑盒、Access RT-PCR系統和T4連接酶美國Promega公司；凝膠產物回收試劑盒和質粒提取試劑盒Axygen公司；NcoI、XhoI、EcoRI和NotI限制性內切酶美國NEB公司；Premix Taq TaKaRa；gelred核酸染料Biotium公司；DNA marker（DL 5000） 北京全式金生物技術有限公司；蛋白質marker（pageruler） Fermentas公司；其他所用試劑為國產或進口分析純試劑。

紫外/可見分光光度計NanoVueGE-healthcare公司；Powerpac Universal電泳儀Bio-Rad公司；PCR儀Applied Biosystems公司；凝膠成像儀（Imaging G3） 北京昊諾斯科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1總RNA的提取按照總RNA提取試劑盒操作步驟分離純化豬肝細胞總RNA。利用分光光度計測定所提RNA濃度的OD值，以OD260nm/OD280nm判定RNA純度。取5 μL所提RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA完整性。將檢測后符合要求的RNA在-80℃保存備用。

1.2.2引物的設計合成參照NCBI上已知的豬（Sus scrofa）β2AR序列（GenBank登錄號AF000134），依據其序列特點，應用Primer 5.0軟件設計1對引物，并在上游引物5′端和下游引物5′端分別引入NcoI酶切位點（下劃線部分）和XhoI酶切位點（下劃線部分），引物序列如下所示：

1.2.3RT-PCR制備豬β2AR的cDNA以所提的豬肝細胞總RNA為模板，參考RT-PCR試劑盒操作步驟進行RT-PCR反應。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物。采用50 μL的反應體系，具體如下所示：水（無核酸酶）22 μL，AMV/Tfi 5×反應緩沖液10 μL，dNTP混合物（每dNTP 10 mmol/L）1 μL，上游引物（10 pmol/μL）5 μL，下游引物（10 pmol/μL）5 μL，MgSO4（25 mmol/L）2 μL，輕微渦旋混勻后加入AMV反轉錄酶（5 U/μL）1 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，輕微振蕩10 s后加入模板RNA 3 μL。

RT-PCR反應條件：50℃45 min，反轉錄反應；94℃2 min，滅活反轉錄酶及預變性；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃最終延伸10 min，同時設立無菌水為模板的陰性對照。取擴增產物5 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4豬β2AR基因重組克隆質粒的構建將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后，按照凝膠產物回收試劑盒說明書對目的片段切膠回收，將回收產物與PMD18-T Vector按照摩爾比3∶1，在16℃條件下連接12 h。然后將連接產物轉化DH5α感受態細胞并涂布平板，挑取單個白色菌落提取質粒進行PCR和雙酶切鑒定。將經以上步驟鑒定為陽性的重組質粒進行測序鑒定，鑒定正確的質粒命名為pMD-18T-β2AR。

1.2.5豬β2AR基因重組酵母表達質粒的構建據已制備得到的豬β2AR的cDNA序列以及pPICZαA載體上多克隆位點所包含的酶切位點，應用Primer 5.0軟件設計1對引物，在上游引物5′端和下游引物5′端分別引入EcoRI酶切位點（下劃線部分）和NotI酶切位點（下劃線部分），引物序列如下所示：

從陽性克隆菌株中提取質粒DNA，以其為模板，利用上述引物進行PCR擴增。然后用EcoRI和NotI限制性內切酶對PCR產物及pPICZαA載體分別進行雙酶切，酶切產物參考1.2.4中的方法進行回收、連接、轉化和質粒提取，經PCR和雙酶切方法鑒定為陽性的重組質粒，并命名為pPICZαA-β2AR，并進行測序鑒定進一步驗證結果。

1.2.6酵母菌落陽性重組子的PCR鑒定采用限制性內切酶SacI酶切重組質粒pPICZα-β2AR，得到線性化質粒。然后將其經酵母電擊轉化導入自制的畢赤酵母X-33感受態細胞中，用酵母菌落PCR方法鑒定陽性重組子。

2　結果與分析

2.1豬β2AR的cDNA制備

分光光度計法測定所提豬肝細胞總RNA的吸光度值，RNA純度為：OD260nm/OD280nm=1.988，比值在1.8～2.0之間，說明所提RNA中蛋白質或其他有機物的污染在允許范圍內，同時測得RNA濃度為0.6 μg/μL，結合電泳結果說明所提RNA的質量滿足下一步RT-PCR要求。

將所提豬肝細胞總RNA進行RT-PCR擴增，取5 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果如圖1所示，出現了預期大小的單一條帶，大小為1257 bp左右，說明本實驗所設計的引物及反應條件特異性較好。

圖1　RT-PCR電泳結果Fig.1　Assay of agrose electrophoresis of RT-PCR

2.2豬β2AR基因的克隆與鑒定

挑取轉化后獲得的白色菌落于LB液體培養基中，37℃下過夜振蕩培養，提取其中的重組克隆質粒進行PCR鑒定，并用NcoI和XhoI進行質粒雙酶切鑒定。PCR電泳結果如圖2（a）所示，可見重組克隆質粒擴增出了1200 bp左右的特異性條帶；雙酶切電泳結果如圖2（b）所示，該重組克隆質粒經NcoI和XhoI酶切后電泳，出現2條帶：1條為約2700 bp左右的pMD-18T載體條帶，另1條為約1200 bp左右的豬β2AR的cDNA片段。

圖2　重組克隆質粒PCR及雙酶切鑒定結果Fig.2　Identification of recombinant cloning plasmid by PCR and double enzyme digestion

2.3豬β2AR基因序列測定及分析

將PCR及雙酶切鑒定為陽性的重組質粒進行測序，得到全長為1257 bp的β2AR cDNA序列，在GenBank上進行基因序列注冊，登錄號為KF023571.1。圖3所示為β2AR的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列。將其與已發表的豬β2AR（AF000134）比對，基因序列一致性為99.68%，發生4處堿基突變，氨基酸序列一致性為99.28%，發生3處突變，具體為：85GAC（D）→AAC（N），AAT（N）1056→AAC（N），1153GAC GCC（D A）→GAG CCC（E P）（加粗下劃線）。β激動劑與受體結合位點處的氨基酸均未發生突變（圓圈），為后續體外表達具有活性的β2AR奠定了基礎。

采用Compute pI/Mw在線軟件預測豬β2AR蛋白分子質量為46.73 ku。Signal P程序分析表明該基因編碼的蛋白質序列無信號肽序列。將β2AR的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列進行在線BLAST分析，比較豬和其他物種β2AR序列及氨基酸序列的一致性，結果顯示，所列序列均為不同物種β2AR序列，且一致性99%以上的8個基因均為豬β2AR，再次驗證了所克隆基因屬于豬β2AR。該基因與人（Homo sapiens）、野駱駝（Camelus ferus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、大倉鼠（Tscherskia triton）、荷蘭豬（Cavia porcellus）序列的一致性分別為86%、91%、89%、83%和86%，氨基酸序列一致性分別為83%、91%、83%、84%和85%，說明不同物種間β2AR有較高的同源性。

圖3　豬β2AR cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig.3　The cDNA and amino acid sequence of pig β2AR gene

2.4豬β2AR基因重組酵母表達質粒的構建

圖4 重組酵母表達質粒pPICZαA-β2AR PCR及雙酶切鑒定結果Fig.4　Identification of pPICZαA-β2AR by PCR and double enzyme digestion

將所構建的重組酵母表達質粒進行PCR鑒定及EcoRI和NotI質粒雙酶切鑒定。以載體的上、下游引物5’AOX1primer和3’AOX1primer為引物對重組質粒進行PCR鑒定，PCR產物片段長度應為載體上片段長度（550 bp）和目的片段長度（1254 bp）之和，約為1800 bp左右。PCR電泳結果（圖4a）顯示，該重組質粒擴增出了1800 bp左右的特異性條帶。雙酶切電泳結果（圖4b）顯示，該重組質粒經EcoRI和NotI雙酶切后，電泳出現2條帶：一條為pPICZαA載體條帶（約3600 bp左右），另一條為目的基因片段（約1200 bp左右）。將經上述鑒定為陽性的重組質粒進行測序鑒定，表明質粒讀碼框正確，說明重組酵母表達質粒構建成功，可用于后續酵母真核系統的表達。

2.5酵母菌落PCR鑒定陽性重組子

挑取Zeocin抗性克隆進行菌落PCR鑒定陽性重組子。分別以pPICZαA空質粒和pPICZαA-β2AR作為陰性對照和陽性對照，引物采用載體引物5’AOX1primer和3’AOX1primer，電泳結果如圖5所示。陽性重組子與pPICZαA-β2AR擴增的條帶大小一致，約為1800 bp。而pPICZαA空質粒沒有擴增出相應條帶，說明β2AR基因已成功整合到X-33宿主菌基因組中。

圖5　轉化子菌落PCR鑒定結果Fig.5　Identification of transformant by colony PCR

3　結論

本研究從豬肝細胞中克隆得到β2AR基因，全長為1257 bp，蛋白分子量預測為46.73 ku。與GenBank上已發表的其他豬β2AR基因序列相比，核苷酸水平同源性均在99%以上，與其他動物和人的β2AR基因的同源性也在83%以上，說明β2AR基因具有較高的保守性，不同物種間同源性較高。將該β2AR基因克隆到pPICZα A載體，成功構建可在畢赤酵母系統體外表達的重組表達質粒pPICZαA-β2AR，為該基因在畢赤酵母細胞中的體外表達提供了技術支持。

［1］何方洋.克倫特羅單克隆抗體的制備與鑒定［D］.北京：中國農業大學，2001.

［2］Sheu S Y，Lei Y C，Tai Y T，et al.Screening of salbutamol residues in swine meat and animal feed by an enzyme immunoassay in Taiwan［J］.Analytica Chimica Acta，2009，654（2）：148.

［3］王鳳俠.動物組織中萊克多巴胺殘留免疫檢測方法研究［D］.天津：天津科技大學，2007。

［4］郭荷梅，杜紅麗，劉文生，等.萊克多巴胺膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制［J］.廣東農業科學，2009（2）：82-84，2007.

［5］He P，Wang Z，Zhang L，et al.Development of a label-free electro-chemical immunosensor based on carbon nanotube for rapid determina-tion of clenbuterol［J］.Food Chemistry，2009，112（3）：707-714.

［6］Zhang X F，Zhao H，Xue Y，et al.Colorimetric sensing of clenbuterol using gold nanoparticles in the presence of melamine［J］.Biosensors and Bioelectronics，2012，34（1）：112-117.

［7］呂會田，張云，樂佳昌，等.旋轉生物傳感器高靈敏檢測鹽酸克倫特羅方法研究［J］.食品科學，2007，28（8）：446-450.

［8］Cherezov V，Rosenbaum D M，Hanson M A，et al.Highresolutioncrystalstructureofanengineeredhumanβ2-adrenergic G protein-coupled receptor［J］.Science，2007，318：1258-1265.

［9］呂寶璋，盧健，安明榜.受體學［M］.合肥：安徽科學技術出版社，2000：135-137.

［10］Liang W，Bidwell C A，Williams S K，et al.Rapid communication：molecular cloning of the porcine β2-adrenergic receptor gene［J］.Journal of Animal Science，1997，75（10）：2824.

［11］Nygaard R，Zou Y，Dror R O，et al.The dynamic process of β（2）-adrenergic receptor activation［J］.Cell，2013，125（3）：532-542.

［12］DiPilatoa L M，Zhang J.The role of membrane microdomains in shaping β2-adrenergic receptor-mediated cAMP dynamics［J］. Molecular Bio Systems，2009，5（8）：832-837.

［13］Dror R O，Arlow D H，Maragakis P，et al.Activation mechanism of the β2-adrenergic receptor［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（46）：18684-18689.

［14］Horst R，Liu J J，Stevens R C，et al.β2-adrenergic receptor activation by agonists studied with 19F NMR spectroscopy［J］. Angewandte Chemie International Edition，2013，52（41）：10762-10765.

［15］宋榮.β2腎上腺素受體基因的克隆及表達［D］.北京：中國農業科學院，2005.

［16］王迪.β2受體的表達、純化及在快速檢測中的應用［D］.北京：中國農業科學院，2008.

Cloning of β2adrenergic receptors cDNA and construction of yeast expression plasmid

WANG Jian1，2，LI Yong-fei1，SHE Yong-xin1，JIN Mao-jun1，WANG Jing1，*
（1.Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agri-products of CAAS，Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2.Department of Food Science，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China）

This study aimed to clone pig β2AR gene，analysize its sequence and construct its recombinant yeast expression plasmid.Total RNA was extracted from pig liver，and then RT-PCR was conducted based on published pig β2AR gene sequence（AF000134）.By cloning of the PCR product and identification，the cDNA fragment of pig β2AR was obtained.Bioinformatical tools were adopted to analyze the gene sequence and amino acid.The target gene was cloned to pPICZα A vector，constructing recombinant expression plasmid. The cDNA fragment of pig β2AR（KF023571.1）was 1257 bp，and encodeed 418 amino acids.The deduced protein was predicted to have a computed molecular mass of 46.73 ku.There were high similarity（more than 83%）and homology in β2AR gene between pig and other species.Finally，recombinant plasmid named pPICZαA-β2AR was constructed successfully after verification by PCR，restriction enzyme analysis and sequencing.This research will serve as a base for expression of pig β2AR gene in yeast expression system and its application in multiresidue determination of β2-adrenoceptor agonists.

β2adrenergic receptor；clone；yeast expression plasmid；pig

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.023

2015－02－05

王健（1980-），男，博士研究生，副教授，研究方向：農產品質量安全快速檢測技術，E-mail：xuanyuanjian0228@126.com。

王靜（1963-），女，博士，教授，研究方向：食品安全與檢測技術，E-mail：w_jing2001@126.com。

國家公益性行業（農業）科研專項（201203094）。