溫度和pH對不同鐮刀菌生長及產毒的影響

師　　雯，韓　　錚，武愛波，王周平（1.江南大學食品學院，江蘇無錫141；.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海01403）

溫度和pH對不同鐮刀菌生長及產毒的影響

師雯1，2，韓錚2，武愛波2，王周平1，*
（1.江南大學食品學院，江蘇無錫214122；2.上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，上海201403）

以從小麥、玉米、大米、大麥等作物中分離得到的12株不同種類的鐮刀菌菌株為研究對象，探究不同溫度和pH對其生長及產毒的影響。結果表明，鐮刀菌在10～35℃和pH3～11范圍內均能夠生長，最適溫度為20～30℃，最適pH為6～8。供試鐮刀菌能夠產生的毒素主要為A型單端孢霉烯族毒素、B型單端孢霉烯族毒素、伏馬毒素和鐮刀菌酸，產毒溫度為5～40℃，但不同菌株的最適產毒溫度存在差異；產毒過程受pH影響較大，過酸（pH3～5）及過堿（pH9～11）的條件下均未檢測到任何毒素?？傮w上看，不同種類鐮刀菌產毒類型存在差異，毒素產量受溫度和pH影響比生長更大，且大多數菌株的生長與產毒最適條件并不一致。

鐮刀菌，溫度，pH，生長，產毒

鐮刀菌屬（Fusarium Link.）為半知菌類真菌，瘤座孢科，叢梗孢目，因大型分生孢子多呈鐮刀狀而得名［1］，其種類較多，地理分布極廣，兼寄生或腐生生活，普遍存在于土壤及動植物有機體內，是農作物和經濟作物最重要的病原菌之一；它們對寄主植物具有一定生理活性和非?；宰饔梦稽c，破壞植物細胞膜及超微結構［2］，造成萎蔫、根腐、穗腐等病害，如Fusarium graminearum、Fusarium equiseti能引起小麥和大麥赤霉??；Fusarium verticilloides［3］、Fusarium proliferatum［4］可引起玉米穗腐?。籉usarium oxysporumSchlecht可引起瓜類、茄科、豆科等多種植物枯萎病［5］等，導致作物產量降低甚至絕產，嚴重影響品質和食用價值［6］。鐮刀菌在自然生長過程中還能產生多種真菌毒素，通過食品、飼料等途徑進入食物鏈，侵染大米、玉米等谷物，食用油、面包、啤酒等農產品加工品，以及蛋、奶、肉等畜產品，導致人類和動物食物中毒甚至死亡［7］。據相關統計，全世界每年由于鐮刀菌及其毒素侵染農作物和工業原料使各國遭受的經濟損失可達數千億美元［8-9］，因此鐮刀菌引起的作物病害及其毒素給人類和動物飲食安全帶來的危害已成為不可忽視的問題，明確其生長和產毒的環境因素是有效控制鐮刀菌及其毒素的關鍵。

鐮刀菌的生長和產毒與外界環境條件密切相關［10］，本實驗以從小麥、玉米、大米、大麥等作物中分離得到的12株不同種類的鐮刀菌為研究對象，系統地探究不同溫度及pH對其生長和產毒的影響，明確最適生長和產毒條件，及產毒類型的種間差異，為鐮刀菌引起的植物病害及食品儲存中毒素污染的防治技術提供一定理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試鐮刀菌菌株信息見表1，均由上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所提供，實驗前于4℃保存在PDA斜面上；甲醇、乙腈色譜純，德國Merck公司；醋酸銨色譜純，上海安普生物科技有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂分析純，國藥集團化學試劑有限公司（上海）；脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀烯醇（3-ADON）、15-乙?；撗跹└牭断┐迹?5-ADON）、雪腐鐮刀烯醇（NIV）、鐮刀菌烯酮-X（Fus-X）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）、新茄鐮刀孢醇（NEO）、蛇形毒素（DAS）、伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、鐮刀菌酸（Fusaric acid）標準品美國Sigma公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato Dextrose Agar，PDA）馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1000 mL、自然pH，121℃滅菌20 min；馬鈴薯葡萄糖肉湯（Potato Dextrose Broth，PDB）馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，121℃滅菌20 min。

表1　供試鐮刀菌菌株信息Table 1　Information of Fusarium strains in this study

MJ-250F-1霉菌培養箱、DHG-9240A鼓風干燥機上海天呈實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺上海博訊實業有限公司；PE20pH計上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SX-500TOMY高壓滅菌鍋上海田源生物技術有限公司；LCMS-8030三重四極桿液質聯用儀日本島津（SHIMAADAU）有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株活化將4℃封存于PDA斜面上的鐮刀菌菌株分別接種于新配制的PDA固體培養基平板，25℃活化培養7 d；再將活化后的各菌株菌絲轉接于新配制的PDA培養基上，25℃恒溫培養7 d，保證菌種活力，并用滅菌打孔器從新鮮菌落邊緣切取直徑為6 mm的菌餅，用于接種。

1.2.2溫度對鐮刀菌生長及產毒的影響采用菌絲生長速率法測定溫度對鐮刀菌生長的影響。將15 mL PDA培養基倒入直徑為9 cm的培養皿中，待冷卻凝固后，每皿正中接入一塊菌餅，菌絲面朝下，分別于5、10、15、20、25、30、35和40℃的溫度條件下恒溫培養，相對濕度保持恒定，每個處理重復3次。培養7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，以兩次測量的平均值作為測量結果，減去菌餅直徑（6 mm）即為菌落直徑；再將PDA培養基連同已知質量的培養皿一同從培養箱中取出，并于40℃的烘箱中烘烤48～60 h后稱重，當培養基的質量烘至1.0 g時，從培養皿中取出，移至50 mL離心管，搗碎并進行毒素提取和測定。

1.2.3pH對鐮刀菌生長及產毒的影響采用菌絲體干重法測定pH對鐮刀菌生長的影響。將100 mL PDB培養基分裝入250 mL三角錐瓶中，滅菌后用磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.05 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L NaOH緩沖液）將pH分別調至3、4、5、6、7、8、9、10和11。每瓶接入一塊菌餅，于25℃下恒溫靜置培養，相對濕度保持恒定，每個處理重復3次。培養7 d后，用已知質量的無菌濾紙濾去培養基，收集菌絲體，于40℃下烘干至恒重，準確稱量，減去濾紙質量即為菌絲體干重；將培養基濾液振蕩均勻，吸取1.0 mL于50 mL離心管中進行毒素提取和測定。

1.2.4LC-MS/MS毒素檢測方法鐮刀菌毒素提取和檢測均采用本實驗室前期已建立的LC-MS/MS分析檢測技術，樣品前處理、色譜及質譜參數參照文獻［11］。

1.3數據處理

應用SPSS17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）和Graphpad prism 5.0（Graphpad Software，Inc.，San Diego，CA）等統計分析軟件對實驗數據分析整理。實驗結果用平均值±標準偏差（mean±SD）表示，數據間差異顯著水平以p＜0.05表示。

2　結果與討論

2.1溫度和pH對鐮刀菌生長影響

2.1.1溫度對生長影響鐮刀菌菌株在不同溫度條件下培養7 d后的菌落直徑見表2，由結果可知，同一溫度下不同菌株的生長速率存在差異（p＜0.05），但不同溫度下的生長趨勢具有相對一致性。鐮刀菌對溫度適應范圍較寬，菌絲在10～35℃溫度范圍內均可生長；但對溫度變化較為敏感，不同培養溫度下同一菌株的菌落擴展速率差異顯著（p＜0.05），其中20～30℃為最適宜生長溫度范圍，菌絲生長較快，除F.tricinctum最適生長溫度為20℃外，其他菌株均為25℃；溫度低于20℃或高于30℃時，菌絲生長逐漸緩慢；而當溫度降至5℃或達到40℃時，菌絲停止生長。

表2　不同溫度對鐮刀菌菌絲生長的影響（n=3）Table 2　Effect of different temperatures on mycelia growth of Fusarium fungi（n=3）

表3　不同pH對鐮刀菌菌絲生長的影響（n=3）Table 3　Effect of different pH values on mycelia growth of Fusarium（n=3）

2.1.2pH對生長影響鐮刀菌菌株在不同pH條件下培養7 d后的菌絲體干重見表3。由結果可知，同一pH下不同菌株生長速率存在差異（p＜0.05），但不同pH下的生長趨勢具有相對一致性。鐮刀菌生長對pH要求不嚴格，pH3～11范圍內均能夠生長；但在不同pH條件下，同一菌株的菌絲體干重差異顯著（p＜0.05），其中pH6～8為最適宜生長酸堿度，但各菌株最適生長pH存在差異；當pH小于6或大于8時，菌絲體生長逐漸緩慢，表明過酸或過堿的培養環境不利于鐮刀菌的生長，而中性或中性略偏酸堿的環境則能使其更好生長。

2.2溫度及pH對鐮刀菌產毒影響

2.2.1溫度對產毒影響不同種類的鐮刀菌產生毒素的種類不相同，主要包括B型單端孢霉烯族毒素（NIV、Fus-X、DON、3-ADON及15-ADON）（圖1）、A型單端孢霉烯族毒素（T-2、HT-2、NEO及DAS）（圖2）、伏馬毒素（FB1、FB2）及鐮刀菌酸（Fusaric acid，圖3～圖4）；同一種鐮刀菌毒素可由多種鐮刀菌產生，每種鐮刀菌的產毒種類也并不單一。

從圖1~圖3可知對大多菌株而言，溫度為5℃時，不產毒或產毒量很低；溫度從5℃升高至15℃，產毒量隨溫度升高而緩慢增加；在20～35℃范圍內，各菌株的產毒量顯著升高，并達到產毒最高點；溫度達到40℃時，產毒量回落到底點。然而，F.langsethiae和F.sporotrichioides的產毒趨勢有所不同（圖2），溫度為10～25℃時，兩株菌株的產毒量達到高點，而在25～35℃溫度范圍內，產毒量則很低。對比不同溫度條件下不同鐮刀菌的產毒情況，發現溫度對鐮刀菌產毒的影響比對生長的影響更加復雜，并且不同菌株的最適產毒溫度及產毒能力存在明顯差異。

圖1　不同溫度對產B型單端孢霉烯族毒素鐮刀菌產毒的影響Fig.1　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-B trichothecenes producer

2.2.1.1產B型單端孢霉烯族毒素菌株由圖1可知，F.culmorum、F.poae及F.meridionale主要產生NIV和Fus-X兩種毒素，F.graminearum能夠產生DON及其乙酰化衍生物。F.culmorum在20℃時產毒量最大（NIV：212.00 μg/kg，Fus-X：43.74 μg/kg），30℃次之；F.poae在25℃時產毒水平最高（NIV：612.71 μg/kg，Fus-X：135.75 μg/kg）；F.meridionale則在30℃時具有最大產毒量（NIV：346.53 μg/kg，Fus-X：38.57 μg/kg），且顯著高于25℃和35℃；而F.graminearum的最適產毒溫度則為30℃（DON：15919.70 μg/kg，3-ADON：7763.06 μg/kg，15-ADON：5194.82 μg/kg）。

圖2　不同溫度對產A型單端孢霉烯族毒素鐮刀菌產毒的影響Fig.2　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of type-A trichothecenes producer

2.2.1.2產A型單端孢霉烯族毒素菌株由圖2可知，F.langsethiae、F.sporotrichioides和F.polyphialidicum主要產A型單端孢霉烯族毒素。F.langsethiae在15℃時產毒量最高（T-2：5089.32 μg/kg，HT-2：347.10 μg/kg，DAS：411.799 μg/kg，NEO：2478.05 μg/kg），20℃次之；F.sporotrichioides和F.polyphialidicum的最適產毒溫度分別為15℃和25℃。

2.2.1.3同時產伏馬毒素（FB1、FB2）和鐮刀菌酸菌株由圖3可知，F.fujikuroi、F.proliferatum和F.verticillioides能夠同時產生FB1、FB2和鐮刀菌酸。F.fujikuroi的最適產毒溫度為25℃（FB1：17.15 μg/kg，FB2：3.43 μg/kg，鐮刀菌酸：2.06 μg/kg），其次為30℃；F.proliferatum和F.verticillioides則在30℃時產毒量最大。

圖3　不同溫度對同時產伏馬毒素和鐮刀菌酸的鐮刀菌產毒的影響Fig.3　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fumonisins and fusaric acid producer

圖4　不同溫度對產鐮刀菌酸的鐮刀菌產毒的影響Fig.4　Effect of different temperatures on mycotoxins production of Fusarium species of fusaric acid producer

2.2.1.4產鐮刀菌酸菌株由圖4可知，F.tricinctum和F.oxysporum僅檢測到鐮刀菌酸一種毒素。30℃為F.tricinctum的最適產毒溫度，產毒量為171.93 μg/kg，其次是25℃；而F.oxysporum的最適產毒溫度則為35℃，產毒量為212.98 μg/kg。

值得注意的是，大多數菌株的產毒最適溫度與各自的最佳生長溫度不一致；尤其在10～20℃和30～35℃溫度范圍內，有些菌株的生長水平逐漸降低，但產毒水平依然較高。Ramirez等［12］發現小麥培養基中，F.graminearum最佳生長溫度為25℃，DON的最大產毒量溫度為30℃，此時菌株的生長速率顯著降低；Nazari等［13］報道F.langsethiae和F.sporotrichioides的最適生長溫度分別為20～25℃和25～30℃，而最適產毒溫度則為10～15℃，此時菌株生長極為緩慢；這些報道與本文研究結果一致，可見食品及飼料中即使沒有明顯的菌株生長跡象，但可能已存留了大量真菌毒素；此外，低溫條件下（5℃）菌絲生長基本停止，但部分鐮刀菌仍然能夠產生少量毒素，說明食物長期低溫存放也并非絕對安全。

鐮刀菌毒素是鐮刀菌在自然生長過程中產生的具有毒性的次級代謝產物，也可認為是其因外界環境改變而產生的適應反應，因此其毒素的產生往往同細胞生長及外界環境等因素密切相關［7］；可能正是因為細胞內利于菌株生長的物質和參與毒素合成的代謝物對不同溫度的敏感程度不同，從而導致各菌株的最適生長與產毒條件存在差異。

2.2.2pH對產毒影響鐮刀菌的產毒對酸堿度較為敏感，pH3～5和pH9～11范圍內均未檢測到任何毒素；產毒主要出現在pH6～8范圍內（表4），與生長適宜范圍一致，表明中性或中性略偏酸堿的環境有利于鐮刀菌的產毒，但最佳產毒pH與各自最佳生長pH依然存在差異。

表4　不同pH下鐮刀菌產毒水平（n=3）Table 4　Levels of mycotoxins produced by Fusarium under different pH values（n=3）

3　結論

分析不同溫度和pH對鐮刀菌生長及產毒情況的影響，結果表明，相同培養條件下不同鐮刀菌的生長速率存在差異，但在不同溫度或pH下的生長趨勢具有相對一致性，鐮刀菌在10～35℃和pH3～11范圍內均能夠生長，最適溫度及pH范圍為20～30℃和pH6～8。不同鐮刀菌產毒類型存在差異，產毒溫度為5～40℃，但不同菌株之間最適產毒溫度不相同；產毒過程受pH影響較大，過酸（pH3～5）及過堿（pH9～11）的條件下均未檢測到任何毒素。因此，鐮刀菌毒素的產生受溫度和pH影響比生長更大，且大多數菌株的生長與產毒最適條件并不一致。由于本研究中得到的鐮刀菌生長和產毒適宜條件與很多作物栽培區的環境條件基本一致［14-15］，建議在作物種植時，適當調節土壤酸堿度（pH），及時修剪殘株病枝，注意鐮刀菌病害的防控；食品及飼料儲存時也要注意溫度控制，減少鐮刀菌毒素的產生和蔓延；該研究結果也為鐮刀菌及其毒素發生規律的進一步研究提供了一定理論依據。

［1］魏最超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W技術出版杜，1979：609.

［2］劉開軍，羅少波，王亞琴，等.鐮刀菌毒素對植物形態和結構的影響［J］.中國農學通報，2010，26（4）：53-56.

［3］Murillo WA，Munkvold GP.Systemic infection by Fusarium verticillioides in maize plants grown under three temperature regimes［J］.Plant Disease，2008，92（12）：1695-1700.

［4］Andreas G，Erich CO，Ulrike S，et al.Biodiversity of Fusarium species causing ear rot of maize in Germany［J］.Cereal Research Communications，2008，36：617-622.

［5］沈瑞清，張萍，郭成瑾，等.寧夏鐮刀菌屬（Fusarium Link）真菌的研究［J］.安徽農業科學，2012，40（16）：8869-8870.

［6］張向民.鐮刀菌屬分類學研究歷史與現狀［J］.菌物研究，2006，3（2）：59-62.

［7］張岳平.鐮刀菌真菌毒素產生與調控機制研究進展［J］.生命科學，2011，23（3）：311-316.

［8］Bai GH，Shaner G.Management and resistance in wheat and barley to Fusarium head blight［J］.Annu Rev Phytopathol，2004，42：135-161.

［9］Rubella SG，Kistler HC.Heading for disaster：Fusarium graminearum on cereal crops［J］.Molecular Plant Pathology，2004，5（6）：515-525.

［10］李鵬，賴衛華，金晶.食品中真菌毒素的研究［J］.農產品加工·學刊，2005（3）：12-15.

［11］Han Z，Feng ZH，Shi W，et al.A quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe samplepretreatment and liquid chromatography with tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantification of 33 mycotoxins in Lentinula edodes［J］.Journal of separation science，2014，37：1957-1966.

［12］Ramirez ML，Chulze S，Magan N.Temperature and water activity effects on growth and temporal deoxynivalenol production by two Argentinean strains of Fusarium graminearum on irradiated wheat grain［J］.International Journal of Food Microbiology，2006，106：291-296.

［13］Nazari L，Pattori E，Terzi V，et al.Influence of temperature on infection，growth，and mycotoxinproduction by Fusarium langsethiae and F.sporotrichioidesin durum wheat［J］.Food Microbiology，2014，39：19-26.

［14］Guo MK，Wang XM，He SQ，et al.Occurrence of maize kernel rot and corn stalk rot in Gansu in 2009［J］.Plant Protection，2011（4）：32.

［15］劉恩勇，王玲，劉連盟，等.層出鐮刀菌的生物學特性及其毒素研究［C］.中國植物病理學會2010年學術年會論文集，2010.

Effect of temperature and pH on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species

SHI Wen1，2，HAN Zheng2，WU Ai-bo2，WANG Zhou-ping1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Institute for Agri-food Standards and Testing Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

In order to investigate the influences of temperature and pH value on the growth and mycotoxins production of various Fusarium species，a total of 12 strains，which isolated from wheat，maize，rice and barley，were studied in present study.The results showed that a wide range of 10～35℃and pH3～11 suitable for their growth were observed，and the optimum temperatures and pH values range were 20～30℃ and pH6～8. Different types of mycotoxins including type-A trichothecenes，type-B trichothecenes，fumonisins and fusaric acid were produced by the Fusarium investigated in current study.The temperature for the mycotoxins production was in the range of 5～40℃.The mycotoxin production were significantly affected by the variation in pH values，and peracid（pH3～5）or parlkaline（pH9～11）conditions would inhibit mycotoxins synthesis.On the whole，the mycotoxins production profiles were various between different Fusarium species，and more effects of temperature and pH values were observed on the mycotoxins production than that on the growth of fungi.For most Fusarium strains，the optimum conditions for mycotoxins production were inconsistent with the Fusarium growth itself.

Fusarium；temperature；pH；growth；mycotoxin production

TS201.6

A

1002-0306（2015）18-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.015

2015－02－02

師雯（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全檢測，E-mail：sw1596321@sina.com。

王周平（1974-），男，教授，研究方向：食品安全檢測，E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn。

國家自然科學基金（31471661）。