KCl部分替代NaCl對干腌火腿工藝過程中蛋白質水解的影響

黎良浩，王永麗，唐　靜，王　健，吳海舟，楊蓉蓉，章建浩（國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心，農業部畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇省食品安全與營養協同創新中心，南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095）

KCl部分替代NaCl對干腌火腿工藝過程中蛋白質水解的影響

黎良浩，王永麗，唐靜，王健，吳海舟，楊蓉蓉，章建浩*
（國家肉品質量與安全控制工程技術研究中心，農業部畜產品加工與質量控制重點開放實驗室，江蘇省食品安全與營養協同創新中心，南京農業大學食品科技學院，江蘇南京210095）

為了降低干腌火腿鈉含量，應用40%KCl替代NaCl對火腿原料進行腌制，采用強化高溫成熟現代工藝制備干腌火腿，分析加工過程中火腿股二頭肌鹽分含量、水分含量、pH、蛋白水解指數、肽氮和氨態氮含量，研究KCl替代對火腿加工過程中組織蛋白酶B和L潛在酶活力變化的影響。結果表明：40%KCl替代NaCl對火腿中組織蛋白酶B和L潛在酶活力變化無顯著影響（p＞0.05），風干成熟產品理化指標、蛋白水解指數、肽氮和氨態氮含量等無顯著差異（p＞0.05），說明采用40%KCl替代NaCl對干腌火腿的蛋白質降解過程無顯著影響（p＞0.05）。

火腿，KCl替代，蛋白質水解，組織蛋白酶

以金華火腿為代表的中國傳統火腿因其色澤鮮亮，滋味豐富、風味美好而廣受國內外消費者喜愛。但傳統火腿因其加工周期長（8～10個月），產品質量不穩定、鹽分含量高（8%～12%）的缺點限制了其消費規模。國內章建浩等［1-2］利用人工氣候調節系統成功地將干腌火腿的加工周期縮短到了80 d，獲得了質量穩定、感官品質達到傳統火腿標準的現代工藝產品。

火腿因其獨特的加工特點及保藏需要，食鹽的使用量很高，然而，有醫學研究表明飲食高鈉與心血管疾病的發生呈正相關性［3］。國內外學者為降低肉制品中氯化鈉含量已開展較多研究，主要是通過降低加工肉制品中氯化鈉添加量和用其他鹽（KCl、MgCl2、CaCl2）部分替代氯化鈉來實現。Alino等［4］用KCl、CaCl2和MgCl2部分代替NaCl，Guardia等［5］用KCl與乳酸鉀混合物替代發酵香腸中50%的NaCl，發現可顯著降低產品鈉離子含量且產品品質無顯著影響。吳海舟等［6］以豬后腿肉為原料制作培根，添加20%～60%的KCI部分替代NaCl研究其對蛋白質降解及產品感官品質的影響，得出最佳替代比例為40%。以上研究表明用KCI來部分替代NaCl降低干腌肉制品中鈉離子含量是一種最可行的方法［7-10］。

由于NaCl與火腿中蛋白質的降解變化緊密相關［11］，因此KCl的使用可能會對蛋白質的降解過程產生影響。目前，國內對使用KCI來部分替代NaCl進行火腿腌制加工的研究尚待完善，KCl的使用對蛋白質降解過程的影響還有待明確。本文采用40%的KCl替代NaCl對火腿進行腌制，采用強化高溫風干成熟新工藝來加工火腿，研究了食鹽替代對火腿加工過程中的蛋白質降解規律的影響，為開發低鈉新工藝火腿提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豬后腿（肥膘適中、重量在（15±0.5）kg，經火腿師傅修割成型） 江蘇省長壽集團提供；氯化鉀（食品級） 連云港樹人科創食品添加劑有限公司；食鹽南京市售；Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC（≥98%）、AMC、EDTA、Triton X-100、DTT美國Sigma公司；Briji 35北京拜爾迪公司；硝酸銀、硫氰酸鉀、磺基水楊酸、茚三酮、亮氨酸氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國產分析純。

IKA-ULTEA-TURRAXT18型Basic分散機德國IKA公司；Beckman Allegra 64R型高速冷凍離心機美國Beckman Coulter公司；JA2203N型電子天平上海民橋精密科學儀器有限公司；UV-2600型紫外分光光度計日本島津公司；M2e型多功能酶標儀美國MD公司；96孔酶標板Costar公司；2300型KjeltecTM自動凱氏定氮儀丹麥Foss公司；101-O-S型電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療器械廠；JYL-C020九陽料理機九陽股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程及取樣方法火腿制作工藝流程及參數參照章建浩［1］的方法：原料腿選擇→修胚→攤涼→上鹽堆疊→腌制（4℃，60 d）→發酵成熟（10～15℃，75%RH，10 d；16～20℃，65%RH，15 d；21～30℃，55%RH，15 d；31～35℃，60%RH，15 d；35～37℃，70%RH，45 d）→貯藏后熟。實驗設計兩個處理組分別為KCl替代組：腌制用鹽量為6.5%，配比為60%NaCl+40%KCl；食鹽對照組：腌制用鹽量為6.5%，配比為100%NaCl。

取火腿工藝過程中原料（工藝點1）、腌制結束（工藝點2）、成熟30 d（工藝點3）、成熟60 d（工藝點4）、成熟100 d（工藝點5）5個工藝點的股二頭肌中間樣品為實驗材料，每個工藝點各取3條腿，剔除脂肪及可見筋膜后切碎，真空包裝，于-40℃凍藏。

1.2.2水分含量測定按照GB/T 5009.3-2010《食品中水分的測定》中的直接干燥法［12］測定水分含量。

1.2.3鹽分含量測定參照GB/T 9695.8-2008《肉與肉制品中氯化物含量測定》中的佛爾哈德法［13］，鹽分含量以NaCl含量計。

1.2.4pH測定參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品中pH測定》［14］。

1.2.5蛋白質水解指數（P.I.%）測定參照江慧等［15］的方法。

1.2.6氨態氮和肽氮提取根據Ketelaere等［16］方法稍作修改，樣品解凍后剔除可見脂肪、結締組織并絞碎，準確稱取5.000 g與50 mL 0.6 mol/L HClO4混合，高速分散器勻漿三次（5000 r/min，20 s）。勻漿液以5000 r/min離心10 min，上清液用中速定性濾紙過濾并收集濾液，濾渣與10 mL 0.6 mol/L HClO4混合后再以5000 r/min離心10 min，上清液用中速定性濾紙過濾并收集濾液，該濾液與前面所得濾液合并。然后用NaOH溶液調pH至6.0，4℃放置2 h后用蒸餾水定容至100 mL。

1.2.7氨態氮含量（AN）測定采用Palacios等［17］方法稍作修改，取1.2.6中的提取液10 mL與10 mL 10%磺基水楊酸混合，在0～1℃放置17 h。然后用NaOH溶液調pH至6，中速濾紙過濾后蒸餾水定容至50 mL。取樣液1 mL進行茚三酮比色反應，利用亮氨酸繪制標準曲線。

1.2.8肽氮含量（PeN）測定參照Palacios等［17］方法稍作修改，取1.2.6中的提取液3 mL加入到10 mL 6 mol/L HCl溶液，混勻后于120℃沙浴24 h，然后用NaOH溶液調pH至6，過濾后蒸餾水定容至50 mL。取樣液1 mL進行茚三酮比色反應，標準曲線與氨基氮標準曲線一致。肽氮含量為此次得到氮含量與1.2.7中氨基氮含量之差。

1.2.9組織蛋白酶B活力測定參照趙改名［18］的方法。

1.3數據處理與統計分析

實驗重復數為3，所有實驗數據用Microsoft Excel 2010進行整理并用SAS 8.2統計軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），取標準差，平均值之間利用Fisher’s最小顯著差異法（the least significant difference method，LSD）進行差異顯著性檢驗。

2　結果與討論

2.1KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中理化指標的影響

由表1可知，鹽分含量隨著火腿加工過程的進行呈顯著上升的趨勢（p＜0.05），成熟結束處理組間鹽分含量無顯著差異（p＞0.05）。腌制結束時，火腿鹽分含量由0.11%迅速增至4.4%以上，這主要是腌制期火腿肌肉外部滲透壓高，鹽離子迅速進入肌肉組織，同時肌肉大量失水所致。進入風干成熟階段肌肉內部滲透壓壓差變小，火腿鹽分含量上升變得緩慢。

由表1可知，在火腿加工過程中水分含量呈顯著（p＜0.05）下降趨勢，40%KCl替代組和100%食鹽對照組各工藝點之間差異不顯著（p＞0.05），這說明采用40%KCl替代NaCl腌制對火腿加工過程中水分的散失無顯著影響（p＞0.05）。成熟中后期產品水分含量偏差較大，原因可能是樣品在庫房內位置的差異造成表面失水速率有差異。

由表1可知，加工過程中火腿的pH總體略有上升。40%KCl替代組和100%食鹽對照組的pH分別從原料的5.63上升到6.02和6.09，各工藝點之間無顯著性差異（p＞0.05），成熟結束時二者差異也不顯著（p＞0.05）。Ibanez等［19］在干腌香腸中使用KCl替代NaCl時發現，鹽替代對干腌香腸pH影響不顯著（p＞0.05）。各工藝點的pH偏差較大，這可能是由于原料之間差異引起的。

表1　干腌火腿加工過程中理化指標的變化Table 1　Change of the physical and chemical indicators in dry-cured ham during processing

表2　干腌火腿加工過程中多肽氮與氨態氮含量的變化Table 2　Change of PeN and AN in dry-cured ham during processing

2.2KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白水解指數的影響

圖1　干腌火腿加工過程中蛋白水解指數的變化Fig.1　Change of P.I.%in dry-cured ham during processing

蛋白水解指數（P.I.%）表示為非蛋白氮占總氮的比重，被廣泛用于評價加工肉制品蛋白質降解程度［20］，是評價火腿質量的重要指標，經過后熟的金華火腿P.I.%在14～20之間［18］。由圖1可以看出，隨著工藝時間的延長，40%KCl替代組和100%食鹽對照組的蛋白質降解程度都顯著增加（p＜0.05），且二者之間的差異不顯著（p＞0.05）。蛋白質的降解是一個酶促反應過程，蛋白酶的作用環境及潛在酶活力，尤其依賴于時間的積累。腌制期環境溫度低（4℃）限制了蛋白酶活力，蛋白質水解不顯著；進入成熟期，環境溫度升高促進蛋白酶活作用，火腿肌肉中蛋白質發生降解造成多肽、短肽及游離氨基酸的積累，蛋白水解指數迅速（p＜0.05）增長至成熟100 d時的20%左右。成熟后期，蛋白水解指數增加緩慢，可能是由于肌肉中內環境的變化造成蛋白水解酶活性下降，同時積累的肽類可能對蛋白水解過程有反向抑制作用。

2.3KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白降解產物的影響

蛋白質水解會產生大量各種類型的多肽、小肽和氨基酸，它們是火腿產品中主要滋味物質及風味物質的前體物，決定了火腿的感官品質質量。由表2可知，PeN含量在火腿加工過程中總體呈上升趨勢，風干成熟30 d之后顯著上升（p＜0.05）。100%食鹽對照組與40%KCl替代組趨勢一致，且無顯著差異（p＞0.05）。PeN的生成主要發生在風干成熟期，主要是因為肌原纖維蛋白大分子量蛋白片段（＞170 ku）、M-蛋白（160 ku）從風干成熟初期才開始降解，肌球蛋白（43 ku）在風干成熟末期才發生降解［21-22］。PeN在成熟中后期積累量顯著升高（p＜0.05），這可能與肽酶活性升高有關。火腿蛋白質降解后產生的肽類中以小肽為主，而小肽中的二肽為主要降解產物［23］。許多的二肽酶在火腿成熟中后期仍有活性，Zhao等［24］研究金華火腿中的二肽酶（DPP）時發現，成熟結束時DPPⅠ的活性達到并超過加工前的水平。由表2可以看出AN在加工過程中也是逐步積累的，KCl替代組和食鹽對照組變化趨勢一致且無顯著差異（p＞0.05）。成熟初期AN含量顯著升高（p＜0.05），這可能與氨肽酶仍保持較高活力有關［18］，AN在成熟中后期積累速度變慢，這一方面是因為氨肽酶活力降低，另一方面是因為氨基酸類物質向其他風味物質轉化［18］。

2.4KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白酶活性的影響

蛋白質的降解過程是一個酶促反應過程，組織蛋白酶B和L對肌原纖維蛋白具有廣泛的水解活性，并且它們在干腌火腿加工過程中都有活性［25-26］，被認為是引起干腌火腿中蛋白質降解和風味物質形成的主要蛋白酶類［27］，并對干腌火腿的質構品質有顯著影響［28］。由表3可以看出，組織蛋白酶B和L潛在酶活力在KCl替代組和食鹽組間變化趨勢相近，且無顯著差異（p＞0.05）。隨著加工時間的延長，組織蛋白酶B和L的潛在酶活力都呈下降趨勢，這主要是因為隨著加工時間的延長，火腿肌肉水分含量和水分活度下降，鹽分升高，pH升高，內部的環境條件不適宜組織蛋白酶的作用。有研究表明，當aw＜0.95時，組織蛋白酶B、L的活力下降明顯［29-30］。

表3　干腌火腿加工過程中蛋白酶B和L潛在活力的變化Table 3　Change of potential activity of cathepsin B and L in dry-cured ham during processing

表4　40%KCl替代組干腌火腿加工過程中各指標Pearson相關系數Table 4　Pearson correlations of all parameters of dry-curing ham with 40%KCl replacement during processing

表5　100%食鹽組干腌火腿加工過程中各指標Pearson相關系數Table 5　Pearson correlations of all parameters of dry-curing ham with 100%NaCl replacement during processing

2.5干腌火腿加工過程中各指標相關性分析

由表4和表5可以看出，40%KCl替代組和100%食鹽對照組干腌火腿加工過程中，隨著溫度升高，火腿水分散失，鹽分進一步滲透并且含量上升，水分與鹽分都呈極顯著負相關（p＜0.01）。隨著蛋白質降解的累積效應，P.I.%逐步升高，AN、PeN含量逐步增加，這三者之間都呈極顯著正相關（p＜0.01）。同時，由于肌肉內部環境越來越不適宜，組織蛋白酶B和L活性下降，表現為蛋白酶與水分含量的極顯著正相關（p＜0.01），與鹽分含量的極顯著負相關（p＜0.01）。組織蛋白酶B和L最適宜pH為3.0～6.0［18］，因此當蛋白質降解造成pH上升后，組織蛋白酶B和L活性下降，表現為與pH呈顯著負相關（p＜0.01）。

由以上實驗結果可知，采用40%KCl替代NaCl對原料腿進行腌制，對產品的水分、鹽分和pH均無顯著影響（p＜0.05）。由于摩爾質量的不同，采用KCl部分替代NaCl是可以降低鹽含量的，但因為K+相對于Na+更易于在肌肉中擴散［4］，且KCl部分替代NaCl能夠加快NaCl的滲透［31］，當火腿進入高溫成熟期鹽分隨水分的擴散變慢后，股二頭肌的鹽含量并不表現出顯著性差異（p＞0.05）。K+有阻礙脫水的作用［32］，但水分含量受溫度時間的影響更大，因此處理組間水分含量并未表現出顯著性差異（p＞0.05）。蛋白質的降解是一個酶促反應過程，處理組間理化條件的無差異性造成組織蛋白酶活性的無差異性（p＞0.05），繼而蛋白質的水解程度及過程也無顯著性差異（p＞0.05）。pH主要受蛋白水解狀況的影響，因此也不受KCl替代的影響。同時，由于40%的NaCl被KCl所替代，火腿中鈉的含量可以降低40%，新工藝產品更利于健康。但采用KCl替代NaCl后對于鉀離子會產生苦味以及火腿產品中滋味物質如游離氨基酸種類及含量的變化需要進一步的研究。

3　結論

在干腌火腿的現代工藝加工過程中，采用40% KCl替代NaCl對原料腿進行腌制，對產品的理化特性、蛋白質降解程度及產物水平、組織蛋白酶B和L的潛在酶活力無顯著影響，即對產品品質如產品得率、鹽分含量、滋味物質的總含量沒有顯著影響。考慮到鹽替代后Na+含量降低更有利于身體健康，采用40% KCl替代NaCl腌制在火腿的加工中是可行的。這一結論為KCl在肉制品中的應用提供了理論依據。

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Influence of partial replacement of NaCl with KCl on proteolysis during processing of dry-cured hams

LI Liang-hao，WANG Yong-li，TANG Jing，WANG Jian，WU Hai-zhou，YANG Rong-rong，ZHANG Jian-hao*
（National Central of Meat Quality and Safety Control，Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

In order to reduce the sodium-content of dry-cured hams，all hams were produced with modified high temperature mature processing technology and NaCl was replaced by 40%KCl when they were salted.A comparative study was carried out to study the effect of the two salts on salt content，moisture content，pH value，proteolysis index，peptide nitrogen（PeN）and ammonia nitrogen（AN）content，cathepsin（B and L）potential activities of biceps femoris during processing.The results showed that there was no significant difference（p＞0.05）with cathepsin（B and L）potential activities of biceps femoris when 40%NaCl was replaced by KCl.So did physical and chemical indicators，proteolysis index，PeN and AN content of the two final products at the end of the processing（p＞0.05）.Results also showed that it had no significant impact（p＞0.05）on proteolysis of dry-cured ham when 40%NaCl was replaced by KCl.

ham；KCl replacement；proteolysis；cathepsin

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0103-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.012

2015－02－05

黎良浩（1989-），男，碩士研究生，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail：lilh2014@126.com。

章建浩（1961-），男，博士，教授，研究方向：畜產品加工與質量控制，E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn。

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B01）；國家公益性行業（農業）科研專項（201303082-2）；江蘇省蘇北科技發展計劃項目（BC2013415）。