食源性致病菌MALDI-TOF MS檢測方法的建立與應用

周千渝，張延國，黃成才，謝景麗，高青珍，劉　肅，*（.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業部蔬菜品質監督檢驗測試中心，北京0008；.島津企業管理（中國）有限公司，分析儀器事業部，北京0000）

食源性致病菌MALDI-TOF MS檢測方法的建立與應用

周千渝1，張延國1，黃成才2，謝景麗1，高青珍1，劉肅1，*
（1.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，農業部蔬菜品質監督檢驗測試中心，北京100081；2.島津企業管理（中國）有限公司，分析儀器事業部，北京100020）

建立用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）快速檢測并鑒定從鮮食蔬菜中分離到的5種食源性致病菌的方法。以標準菌株為模式菌，考察基質溶液配比、菌株培養條件、溶劑處理方法、點樣方法及比例等條件對鑒定結果的影響，確定最優方法，并考察方法的穩定性、重復性和檢測限。分別用所建立的方法和16S rRNA基因測序法對7株標準菌株和93株分離株進行分析，比較兩者鑒定結果的一致性。結果表明，所建立的方法穩定性良好，檢測限為106～109cfu/mL，菌株鑒定結果與基因測序鑒定結果具有較高一致性（83%在種水平鑒定一致，94%在屬水平鑒定一致）。MALDI-TOF MS法可用于食源性致病菌的準確、快速、低成本、高通量的檢測及鑒定。

MALDI-TOF MS，食源性致病菌，檢測，鑒定

食源性致病菌導致的食品安全問題越來越受到關注。資料顯示，2006年到2010年，我國共收到食源性疾病暴發事件報告2023起，累計發病62920人，死亡967人，其中微生物引起的食源性疾病暴發事件數和患者數最多，分別占40.09%和61.92%［1］。存在于食品介質上的潛在致病菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌等，這些污染若未得到及時監測和有效控制，則對人體存在極大潛在危害［2］。微生物快速檢測技術的應用將為食源性致病菌監測提供重要的技術支撐。

食源性致病菌檢測技術主要包括基于微生物形態學、生理生化反應的傳統方法，分子生物學方法以及免疫學方法。傳統方法操作復雜，檢測周期長；分子生物學和免疫學方法檢測結果靈敏，快速高效，但是實驗操作也相對復雜，成本較高。在實際應用中上述方法不能完全滿足細菌準確、快速、高通量檢測的需要［3-4］。質譜技術的發展為食源性致病菌的快速檢測提供了新思路，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）具體原理是細菌樣品與基質（小分子有機酸）溶液形成的共晶體在激光照射下發生電荷轉移使得樣品分子電離，不同質荷比（m/z）的離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達飛行時間檢測器（TOF）時所用的時間不同而被分離和檢測，所測得的蛋白質及多肽質量指紋圖譜與標準數據庫比對，即可得到鑒定結果［5］。目前，此技術已被應用于多種臨床病原菌的快速鑒定［6］。在我國，MALDI-TOF MS技術在食品安全領域的研究尚處于起步階段，已有的研究表明此技術應用于食源性致病菌鑒定和分型方面是可行的。另外，MALDI-TOF MS技術在真菌毒素檢測、菌株功能蛋白分析、食品過敏源檢測、真偽辨別、產地溯源、細菌耐藥性研究等方面也具有潛在應用價值［7-9］。

基質溶液配比、菌株培養時間及培養基、溶劑處理方法、點樣方法及比例等是影響譜圖質量的主要因素［10-12］，本文以幾種標準菌株為模式菌，考察了以上幾個因素對實驗結果的影響，研究了樣品處理及質譜分析的最佳方法，并通過分析實際分離到的菌株對此方法的準確性和穩定性進行驗證，以期建立一種適用于食源性致病菌的快速檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲酸（FA）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、無水乙醇、α-氰-4-羥基肉桂酸（CHCA） 色譜純，Sigma公司；營養瓊脂（NA）、平板計數瓊脂（PCA）、腦心浸液瓊脂培養基（BHI）、改良山梨醇麥康凱（CT-SMAC）瓊脂、Baird-Parke（BP）瓊脂、PALCAM瓊脂、HE瓊脂、XLD瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、沙門氏菌顯色培養基青島海博生物技術有限公司；腦心浸液肉湯（BHIB） 美國Oxid公司；7株標準菌株：出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7，CICC 21530）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，CICC 21482）、鼠傷寒沙門氏菌2株（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，ATCC 14028、ATCC 49416）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC 23656）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，CICC 21633）；93株蔬菜中分離到的野生菌株均為本實驗室保存。

AXIMA Performance基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀島津公司；DHP-420型電熱恒溫培養箱佳美儀器有限公司；WH-2型微型渦旋混合儀上海瀘西分析儀器廠；TGL-16B型高速臺式離心機安亭科學儀器廠；D-1型高壓蒸汽滅菌鍋湖北永大換熱設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1基質溶液的選擇10 mg的α-氰-4-羥基肉桂酸溶解于1 mL的超純水、乙腈、三氟乙酸的混合溶液（三者的體積比分別為19∶20∶1和49.9∶50∶0.1）中制成基質飽和溶液1和溶液2。以出血性大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656為模式菌，考察不同基質溶液對質譜結果的影響。兩株細菌分別接種于BHI培養基，37℃培養24 h后，無菌操作分別挑取適量菌落（5～10 mg）加入含300 μL超純水的1.5 mL的無菌離心管中，仔細混勻后再加900 μL無水乙醇，再次混勻滅活，12000 r/min高速離心2 min后棄去上清。滅活后的菌體沉淀中先后加入50 μL的70%甲酸和50 μL乙腈，充分懸浮，混勻，以12000 r/min離心2 min提取蛋白，上清液備用。制備的上清液樣品和兩種基質溶液以1∶1的體積比覆蓋法點樣，同一細菌樣品不同基質溶液分別重復點12個孔進行質譜分析。

1.2.2培養條件的選擇以金黃色葡萄球菌CICC 23656和沙門氏菌ATCC 14028標準菌株為模式菌，分別考察不同培養基及培養時間對質譜結果的影響。將金黃色葡萄球菌標準菌株接種于NA、BHI、PCA三種非選擇性培養基上，將沙門氏菌標準菌株接種于BHI、BS、XLD、HE、沙門顯色培養基上，將上述培養基于37℃恒溫培養箱培養24、48、72 h培養后，以1.2.1所述方法滅活并提取蛋白后點樣進行質譜分析，使用上述基質溶液1點樣。同一培養條件平行處理三次，每個處理平行點樣三次。

1.2.3蛋白提取方法的選擇以大腸桿菌ATCC 8739為模式菌，標準菌株接種于BHI培養基于37℃培養24 h后，挑取適量菌落用1.2.1所述方法滅活后，考察以下六種蛋白提取方法（見表1）對結果的影響。滅活菌體沉淀分別按照表1步驟處理后，仔細混勻樣品，以12000 r/min離心2 min，留取上清液備用。每種方法平行處理3個樣品，每個樣品平行點樣三次。

表1　蛋白提取方法Table 1　Protein extraction method

1.2.4點樣及MALDI-TOF MS分析以出血性大腸桿菌CICC 21530為模式菌考察以下不同點樣方法及點樣比例對質譜結果的影響。覆蓋法：移取經上述方法處理后的上清液點至靶板，室溫自然干燥后覆蓋CHCA基質溶液，自然干燥后上機分析，上清液樣品及基質溶液點樣量分別為1 μL+1 μL、0.5 μL+1 μL、1 μL+0.5 μL；夾心法：先在靶板上點0.5 μL基質溶液，干燥后覆蓋1 μL樣品，自然晾干再覆蓋0.5 μL基質溶液；混合干滴法：點靶前樣品和基質溶液等量混合，取1 μL混合液立即點樣，干燥后上機分析。每種點樣方法及比例重復點樣6次，分析鑒定結果一致性。

質譜儀器參數如下：線性操作模式，陽離子模式，檢測范圍：2000～20000 Da；激光點擊數：每圖譜100；激光頻率：50 Hz；離子源加速電壓：20 kV。每次實驗前都要在采集數據的質量范圍內用大腸桿菌標準菌株樣品進行儀器校準，以保證所獲得的離子質量數誤差小于±7。

1.2.5檢測限實驗以大腸桿菌CICC 21530和沙門氏菌CICC 21482各一株為模式菌，考察方法的檢測限。兩株菌株分別接種于10 mL的BHIB中于37℃培養24 h后，分別用0.85%無菌生理鹽水以1∶10的比例梯度稀釋9次。每個稀釋度的菌液各取1 mL，離心棄上清，沉淀菌體用1.2.1的方法處理并以覆蓋法1 μL+ 1 μL點樣分析。每個稀釋度的樣品重復處理三次，每個處理重復點樣三次，通過分析不同稀釋度樣品的鑒定結果的準確性來考察儀器檢測限。同時各取兩者的三個最高稀釋倍數的菌液1 mL用于PCA平板計數，每個稀釋度重復計數三次。

1.2.6穩定性實驗以大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656作為模式菌，三個不同時間分別以同樣的方法處理后進行質譜分析，每個菌株3個平行處理，每個處理重復點樣4次，考察同一批次及不同批次處理后鑒定結果的穩定性。

1.3數據處理

用Shimadzu Biotech launchpad 2.9軟件對采集到的圖譜進行分析比較。采集結果導入到SARMIS數據庫中，與標準圖譜比對，經軟件計算給出相應的得分和鑒定結果。得分在90%～99.9%，結果以綠色標出，表示鑒定結果可信；得分在85%～89.9%，結果以黃色標出，表示鑒定結果可信度較高；得分在70%～85%，結果以白色標出，表示可能的菌屬或者菌種鑒定；得分70%以下不給出鑒定結果。若以紅色標出，表示不可信的鑒定結果或者樣品有雜菌污染。重復處理及點樣的樣品，以平均鑒定得分及其變異系數（C.V）考察鑒定結果的可信度和穩定性。

2　結果與討論

2.1基質溶液的選擇

用基質溶液1和基質溶液2以相同方法點樣分析的所有樣品都得到準確鑒定結果，但用基質溶液1的平均得分稍高。對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，用基質溶液1點樣鑒定平均得分分別為99.9%、99.9%，用基質溶液2點樣鑒定平均得分為94.7%、95.0%。

圖1是大腸桿菌用兩個溶液點樣分析后得到的質譜圖，看出A的特征峰峰形更好，而B的基線噪音較明顯，部分特征峰的位置有偏離，可能是因為基質溶液中的三氟乙酸可以影響樣品和基質的共結晶過程［13］，從而影響數據的采集。使用兩者久置（室溫或者4℃保存一個月）的基質溶液實驗時，這一趨勢更明顯。因此，基質溶液選擇超純水、乙腈、三氟乙酸（體積比19∶20∶1）的CHCA飽和溶液，每次實驗前重新配制。

圖1　大腸桿菌用不同配比的基質溶液點樣得到的質譜圖Fig.1　The spectra of E.coli strains using

2.2培養條件的選擇

不同條件培養金黃色葡萄球菌CICC 23656，鑒定得分見表2。48、72 h培養的個別樣品鑒定得分較低，可能是因為細菌長時間培養產生了代謝物會對結果有所影響，本實驗后續菌株培養時間均為24 h。實際上，細菌只要經過培養在瓊脂平板上形成可方便挑取的菌落即可，一般過夜培養就可達到要求；用NA、PCA、BHI培養金黃色葡萄球菌24 h后，鑒定平均得分均在95%以上，質譜圖無明顯差異，說明三種非選擇性培養基對質譜結果影響不大，但是從幾組鑒定得分的變異系數看出，BHI培養基24 h培養時變異系數最小，結果穩定性更好。

表2　金黃色葡萄球菌經不同培養條件培養后的鑒定得分（%）Table 2　Identification scores of Staphylococcus aureus in different cultivation conditions（%）

沙門氏菌ATCC 14028經BHI、BS、XLD、HE、沙門氏菌顯色培養基分別培養24 h并處理后得到的質譜圖不同特征峰的峰強度稍有差異，但質譜數據導入數據庫通過與標準圖譜比對，軟件計算后，都得到準確鑒定。表3是9個平行樣品的鑒定得分，可看出平均鑒定得分均大于95%，且除了沙門顯色培養基外，其他鑒定得分的變異系數均小于5%，說明非選擇性培養基對鑒定結果幾乎無影響。本實驗統一選擇37℃，BHI培養24 h為后續研究菌株的培養條件。

表3　沙門氏菌經不同培養基培養后的鑒定得分（%）Table 3　Identification scores of Salmonella enteritidis on different culture medium（%）

2.3蛋白提取方法的選擇

六種方法處理大腸桿菌ATCC 8739，得到的譜圖見圖2?？闯龇椒?處理后特征峰數量有所減少，其他圖譜之間各峰強度稍有差異，可能是因為不同提取方法對非特征峰的出峰有影響，但所有樣品都得到準確鑒定，平均鑒定得分均在95%以上，變異系數均小于3%。說明處理方法對特征峰數量及強度影響不大，這與相關文獻的報道不太一致［14］。實驗最終確定用報道較多的70%甲酸和乙腈處理菌株，即為文中提到的方法1。

2.4點樣方法及點樣比例的選擇

不同點樣方法及比例點樣的大腸桿菌所得譜圖見圖3。覆蓋法點樣，前兩者特征峰數量及強度較一致，平均鑒定得分均大于98%，變異系數小于1%，但樣品與基質以覆蓋法1 μL+0.5 μL點樣時，特征峰數量有所減少。夾心法及混合干滴法點樣得到的圖譜基線噪音較大，特征峰數量明顯減少，平均得分分別為90.8%、89.9%，得分變異系數分別為4%、9%。證明點樣方法對實驗結果有較大影響。本實驗后續研究最終選擇覆蓋法1 μL+1 μL點樣。

圖2　不同處理方法處理大腸桿菌得到的質譜圖Fig.2　The spectra of E.coli of different pre-treatment

2.5方法的檢測限

根據最高稀釋倍數的菌液計數結果推算出各個稀釋度的菌濃度。表4為檢測限實驗結果，菌濃度在105cfu/mL以下的稀釋菌液，滅活離心后菌體沉淀幾乎觀察不到，按照處理步驟加溶劑提取蛋白并點樣分析，無法得到鑒定結果。因此確定此方法檢測限為106～109cfu/mL，這個檢測限滿足一般檢測需求。

圖3　不同點樣方法及點樣比例得到的金黃色葡萄球菌質譜圖Fig.3　The spectra of Staphylococcus aureus by different sample/matrix proportion and sample deposition method

表4　檢測限實驗結果Table 4　Results of the detection limit

2.6方法的穩定性

同一批次的大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656樣品不同重復之間鑒定結果高度一致，平均得分均大于95%，變異系數均小于5%；三個不同批次之間，相同菌株的鑒定結果一致，平均得分均大于97%，變異系數均小于5%，且質譜圖無明顯差異，證明此方法穩定性和重復性良好。

2.7與16S rRNA基因測序結果的對比

7株標準菌株，56株根據食品微生物檢驗標準GB 4789的方法［15］從鮮食蔬菜中分離到的食源性致病菌（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌），以及37株分離過程中得到的菌株（包括銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌等涉及食物中毒報道案例的條件致病菌，或按照傳統方法在檢驗過程中以假陽性出現的非常見的野生菌株）。以上共100株菌株分別同時用MALDI-TOF MS法和16S rRNA基因測序法分析，前者有91株鑒定到種水平，5株細菌無鑒定結果。后者92株菌株鑒定到種水平，1株測序結果BLAST比對后無法得到確認。表5是兩方法的鑒定結果對比，其中83株菌株在種水平上兩方法鑒定一致，94株在屬水平上鑒定一致。MALDI-TOF MS法分析的56株常見食源性致病菌除一株沙門氏菌和一株李斯特菌只鑒定到屬水平外，其他的都在種水平上與測序結果鑒定結果相符。此結果說明MALDI-TOF MS方法的可靠性良好。

3　結論與討論

本文建立的菌株處理方法如下：取適量（5～10 mg）新鮮培養的菌株到300 μL超純水中混勻，再加入900 μL無水乙醇充分混勻滅活，12000 r/min高速離心2 min后棄去上清，沉淀中先后加入50 μL 70%甲酸和等量乙腈，仔細混勻后，12000 r/min高速離心2 min，上清液以覆蓋法1 μL+1 μL點樣分析，基質溶液選擇體積比為19∶20∶1的超純水、乙腈、三氟乙酸三者的混合溶液的CHCA飽和液。另外，文中提到的其他處理方法的適用性及穩定性有待進一步研究。

MALDI-TOF MS具有操作簡單，快速（每個樣品2～3 min可完成鑒定），成本低（與傳統方法比較，可降低20%～30%的檢測成本），容易實現大通量檢測等優點［16］，可作為一種主要或輔助方法應用于食源性致病菌監測系統。因為大部分導致食源性疾病的致病菌為未知微生物，用傳統方法很難實現全面的監測，而MALDI-TOF MS常應用于一些用傳統方法難鑒定或者鑒定周期長的微生物的快速鑒定［17-18］，這一點的意義重大。此法也可用于細菌的全細胞分析，即不需要經過溶劑處理，純菌落或菌液可直接點樣，這樣可明顯提高檢測效率，有文獻報道了其應用于多種臨床菌株的全細胞分析［19］。因此，嘗試不同樣品前處理方式，進一步簡化處理步驟，還有數據庫的完善及補充都是今后研究的重點。另外，雖然MALDITOF MS可實現菌株的快速鑒定，但其要求必須得到純菌落或者純菌液，依然依賴于基礎增菌及分離培養階段（一般需要1～3 d），所以此法結合快速復合增菌的研究有助于檢測效率的進一步提高。

表5　MALDI-TOF MS法和16S rRNA基因測序法分析100株細菌的結果比較Table 5　The results of the MALDI-TOF MS method and 16S rRNA gene sequence analysis for 100 strains

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Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification and detection of foodborne pathogens

ZHOU Qian-yu1，ZHANG Yan-guo1，HUANG Cheng-cai2，XIE Jing-li1，GAO Qing-zhen1，LIU Su1，*
（1.Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Supervision and Testing Center for Vegetable Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2.Shimadzu（China）Co.，Ltd.，Analytical Instruments Dept，Beijing 100020，China）

A method based on matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）was developed for rapid discrimination of 5 species of foodborne pathogens which isolated from fresh vegetables.Standard strains were used in the study to investigate factors affecting the identification results，such as the selection of matrix solution，cultivation conditions，solvent treatment method，and the sample deposition method.After determined the optimal protocol，the stability and repeatability of the method were evaluated.Then bacteria strains separated from fresh vegetables were identified by this protocol.The 16S rRNA gene sequence analysis for 93 wild strains and 7 standard strains was used as a reference to evaluate the credibility of MALDI-TOF MS method.The MALDI-TOF MS method showed good stability with appropriate detection limit（106～109cfu/mL）for rapid detection of those strains and high consistency with the 16S rRNA gene sequence analysis（83%consistency at the species level and 94%consistency at the genus level）.It was showed that MALDI-TOF MS could be used as an accurate，quick，cost-effective and high throughput method in the identification of foodborne pathogens.

MALDI-TOF MS；foodborne pathogens；detection；identification

TS207.4

A

1002-0306（2015）18-0059-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.003

2014－12－05

周千渝（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品加工與安全，E-mail：qyzhou1991@163.com。

劉肅（1955-），男，碩士，研究員，研究方向：農產品質量和安全檢測技術，E-mail：liusu@mail.caas.net.cn。

2014年國家蔬菜產品質量安全風險評估項目（GJFP2014001）。