磁性分子印跡固相萃取食品中的四環素類抗生素殘留

王雅群，潘道東（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

磁性分子印跡固相萃取食品中的四環素類抗生素殘留

王雅群，潘道東*
（寧波大學海洋學院，浙江寧波315211）

采用表面分子印跡技術合成對四環素類抗生素具有特異性吸附性能的Fe3O4@SiO2@MIP核殼型納米復合材料，經磁分離固相萃取-高效液相色譜（MSPE-HPLC）技術，同時測定樣品中3種四環素類抗生素的殘留。用掃描電鏡（SEM）、透射電鏡（TEM）和紅外色譜（FT-IR）對其表征。該方法對于四環素、土霉素、金霉素的檢出限分別為9.61、7.84、11.93 μg/kg，且在線性范圍內線性關系良好。最大吸附量為56.28 mg/g。該方法的平均加標回收率在93.71%～100.88%之間，變異系數1.54%～7.44%。與非分子印跡聚合物相比，Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物的吸附特異性較強。

四環素類抗生素，Fe3O4納米粒子，分子印跡，固相萃取，高效液相色譜

四環素類抗生素（Tetracycline Antibiotic）為廣譜型的抗菌藥，常見的有四環素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）和金霉素（Chlortetracycline，CTC），主要用于預防和治療畜禽疾病，但由于藥物的不合理使用，動物源食品中常存在四環素類藥物的殘留問題。美國食品藥品管理局規定上述3種四環素類抗生素最大殘留量為2 μg/g，中國農業部規定3種四環素類抗生素最大殘留量為100 ng/g。因此，食品中四環素類抗生素的檢測十分重要。

目前關于四環素類抗生素檢測方法，大致可以分為四類：微生物檢測法［1］，是最常用的方法，但該方法復雜、耗時、準確性不高；高效毛細管電泳法，有自動化程度高、微量等優點，但存在分析精度不高、專屬性鑒定尺度不易掌握等問題［2］；免疫分析法，因其前處理簡單、靈敏度高等優點，在分析領域占據非常重要的地位，但有檢測對象單一的缺點［3］；儀器分析法，隨著科技的進步以及分析儀器的普及。儀器分析法因具有高靈敏度、快速、準確的特點得到青睞，在多殘留定性定量分析方面優勢突出［4］。食品因其組成基體非常復雜，所以樣品前處理是多殘留檢測的關鍵。而固相萃取技術因其設備簡單、自動化程度高等優點，已廣泛用于樣品前處理［5］。為提高萃取過程特異性，以分子印跡聚合物作固相萃取劑，對樣品前處理，可提高檢測特異性、準確性［6］。近年來，因磁性納米復合材料成本低廉、表面易于改性和磁向導性等優勢，使其在靶向藥物醫學、臨床診斷以及細胞固定化等領域得到廣泛的應用［7-11］。同時，磁性納米印跡材料與傳統的分子印跡材料相比，省去了離心、過濾等復雜過程，簡化了操作步驟和操作時間，使得樣品前處理更快速、更高效［12］。

本文主要合成了Fe3O4@SiO2@MIP核殼型納米分子印跡聚合物，并使用該聚合材料作為固相萃取劑，結合高效液相色譜法，同時測定樣品中3種四環素類抗生素的殘留。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

強力霉素（Doxycycline，DOX）、四環素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、N，N-二甲基乙酰胺（DMAC） 阿拉丁試劑有限公司；3-巰丙基三甲氧基硅烷（MPTS）、甲基丙烯酸（MAA） 國藥集團化學試劑有限公司；三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯（TRIM） 瑪雅試劑有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN）

天津市光復精細化工研究所；四乙氧基硅烷（TEOS） 上海泰坦科技股份有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純迪馬科技有限公司；4種抗生素結構式為：

HH-S數顯恒溫油浴金壇市精達儀器制造有限公司；JEOL2100透射電子顯微鏡（TEM） 日本JEOL電子株式會社；SU-70場發射掃描電鏡（SEM） 日本日立；湘儀H-2050離心機湘儀離心機儀器有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀IRAffinity-1日本島津；高效液相色譜（Agilent 1260） 德國安捷倫公司。

1.2實驗方法

1.2.1磁性分子印跡聚合物的制備

1.2.1.1超順磁性Fe3O4粒子的制備超順磁性Fe3O4磁性納米粒子水懸浮液采用化學共沉淀方法制備。取500 mL的燒瓶，將3.45 g FeCl2·4H2O、9.46 g FeCl3·6H2O分別溶于除氧的160 mL雙蒸水中，氮氣保護下800 r/min強機械攪拌，溶液加熱至80℃后，加入25 mL氨水，使反應溶液呈堿性。反應進行40 min，冷卻后磁分離，倒出上清液，用雙蒸水和乙醇多次淋洗，除去雜質，真空冷凍干燥，即得到黑色超順磁性Fe3O4納米顆粒［13］。

1.2.1.2Fe3O4@SiO2的制備取燒瓶，分別加入120 mg Fe3O4納米材料、200 mL異丙醇、20 mL雙蒸水，混勻，40 Hz超聲20 min。在800 r/min持續機械攪拌下，連續加入22 mL氨水和4.2 mL的TEOS，室溫下反應24 h后，磁分離除上清液，多次清洗，冷凍干燥，得Fe3O4@SiO2納米粒子。

1.2.1.3沉淀聚合法合成Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物取圓底燒瓶，依次加入30 mg Fe3O4@SiO2納米支撐載體、3.0 mmol強力霉素模板分子、60 mL乙腈/甲醇（35∶30，V/V）致孔劑、0.68 mL甲基丙烯酸（MAA）功能單體，超聲除氧，加入10 mmol三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯（TRIM）交聯劑，45 mg偶氮二異丁腈（AIBN），持續通入氮氣，攪拌聚合24 h后，抽濾、洗滌，索氏提取24 h，去除模板分子，冷凍干燥，得Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物。按照以上方法，不加強力霉素，合成對照組的核殼型Fe3O4@SiO2@NIP非分子印跡聚合物［14］。

1.2.1.4結構表征掃描電子顯微鏡（SEM）：采用導電膠粘結法。先在樣品臺上貼上一短條導電膠帶，然后在膠帶上撒少量納米分子粉末，反置樣品臺，使未粘上的樣品脫落，并用吸耳球輕吹表面，待測。

透射電子顯微鏡（TEM）分析：取少量樣品粉末于小燒杯中，加入乙醇溶解，超聲分散20 min，用1 mL移液槍轉移一小滴到200目的銅網上，靜置干燥30 min，待測。

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析：表征樣品與溴化鉀（KBr）以1∶50的比例研磨成粉，壓制成片，數據測試波長范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描扣除CO2干擾。

1.2.1.5色譜條件色譜柱：ZORBAX Eclipse XDBC18，4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent；流動相：0.01 mol/L磷酸二氫鈉（pH2.8）水溶液∶乙腈=79∶21；檢測波長：355 nm；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

1.2.1.6標準曲線用甲醇做溶劑，配制濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.10 μg/mL的四環素和土霉素，濃度為0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00、2.20 μg/mL金霉素的混合標準溶液，按上述色譜條件，作線性回歸分析。以標準溶液的濃度為橫坐標X，以對應液相色譜的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.2.2靜態吸附實驗為了進一步研究核殼型Fe3O4@SiO2@MIP納米分子印跡聚合物的吸附能力，設計靜態吸附實驗，并運用Scatchard分析實驗結果。取10個10 mL離心管，分別加入50 mg的Fe3O4@SiO2@MIP納米分子印跡聚合物，加入5 mL濃度不同（濃度范圍0.2～2 mg/mL）的四環素類抗生素甲醇/水（95∶5，V/V）溶液，混勻振蕩8 h后，磁分離，并收集上清液，用高效液相色譜測定，每個濃度設置三組重復。依據吸附平衡公式（1），計算平衡吸附量Q（mg/g）：

式中：V表示溶液體積（mL）；m表示Fe3O4@SiO2@ MIP納米分子印跡聚合物質量（g）；C0表示溶液初始濃度（mg/mL）；Ce表示溶液吸附平衡濃度（mg/mL）。

按照以上方法測定核殼型Fe3O4@SiO2@NIP納米分子印跡聚合物對土霉素的靜態吸附并進行比較。

1.2.3樣品測定

1.2.3.1樣品預處理樣品中四環素類抗生素的提取采用Mcllvaine緩沖溶液稀釋法，配制Mcllvaine緩沖溶液［15］，固體樣品用組織搗碎機絞碎均勻，將其加入4倍質量的上述緩沖溶液，冰水浴超聲浸提20 min，5000 r/min離心15 min，殘留物用相同方法重復浸提1次，合并浸提液，冷藏待測。

1.2.3.2固相萃取首先，準確稱取50 mg鐵納米分子印跡聚合物，作固相萃取劑，置于離心管中，經10 mL甲醇活化后，雙蒸水清洗至少3次，磁分離，載入5 mL待測浸提液，塞緊瓶口，平放離心管，室溫下吸附30 min后，磁分離，雙蒸水清洗淋洗，去除未被吸附的物質，再用5 mL甲醇/2%甲酸水溶液（V/V，90∶10）進行洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干后，5 mL流動相稀釋，用高效液相色譜測定待測液中的3種四環素類抗生素的濃度。

1.2.3.3加標實驗加標實驗過程中，牛奶樣品是將3種不同四環素類抗生素加入牛奶樣品中，使土霉素、四環素加標濃度分別為0.2、0.4、0.8 μg/mL，金霉素濃度為0.4、0.8、1.6 μg/mL；禽肉、魚肉是將組織搗碎，稱取100 mg的樣品，使土霉素、四環素加標濃度分別為0.2、0.4、0.8 μg/g，金霉素加標濃度為0.4、0.8、1.6 μg/g。每個濃度做5次重復。

1.2.4數據處理方法Origin 9.0.0（OriginLab OriginPro 9.0.0，Origin，ElectronicArtsInc，Cary，Microsoft Windows，USA，2011）用于數據分析和繪圖。

2　結果與討論

2.1磁性分子印跡聚合物的表征

2.1.1掃描電鏡（SEM）圖分析掃描電鏡是最直觀也是目前最常用的觀察聚合物表面微觀形態的手段，本文用掃描電子顯微鏡觀察Fe3O4@SiO2@MIP納米粒子的表面形態，并與Fe3O4納米顆粒進行比較（圖1）。由圖1可以看出，Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物與Fe3O4納米相比，直徑略有增大。Fe3O4納米顆粒外觀更為清晰純凈，而Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物表面更為粗糙，且團聚程度略大于Fe3O4納米顆粒，這與合成Fe3O4@SiO2@MIP的沉淀聚合法有關。

圖1　Fe3O4納米粒子（A，B，100000×）與Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物（C，D，200000×）不同放大倍數的掃描電鏡圖Fig.1　Scanning electron micrographs of Fe3O4nano-particles（A，B，100000×）and Fe3O4@SiO2@MIP（C，D，200000×）under different magnifications

2.1.2透射電鏡（TEM）圖分析為了進一步觀察Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物與Fe3O4納米粒子的內部形貌，采用透射電子顯微鏡觀察。從TEM圖明顯看出，納米粒子大小均勻基本呈球形，而且也沒有特別明顯的分相。Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物粒徑更大，約20～30 nm，而Fe3O4納米粒徑約10～20 nm，可以證明表面印跡成功。

圖2　Fe3O4納米粒子（A，200000×）與Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物（B，200000×）的透射電鏡圖Fig.2　Scanning transmission electron micrographs of Fe3O4nano-particles（A，200000×）and Fe3O4@SiO2@MIP（B，200000×）

2.1.3紅外圖譜（FT-IR）分析紅外光圖譜的特異性程度較高，可以用來研究分子的結構和化學鍵，也可用來表征和鑒別化合物。分別測定了Fe3O4納米材料、硅烷化的Fe3O4@SiO2納米聚合物和Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物的紅外光譜圖（圖3）。

圖3　Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@MIP的紅外光譜Fig.3　FI-IR spectra of Fe3O4、Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2@MIP

在紅外光譜圖中，Fe3O4吸收峰在580～400 cm-1之間，很明顯，圖3中445.56 cm-1為Fe3O4的Fe-O彎曲振動特征峰，592.12 cm-1為Fe3O4的Fe-O伸縮振動特征峰基團頻率發生位移［16］。1317.37 cm-1是Si-O-Si反對稱振動吸收峰，1120.64 cm-1是Si-O的伸縮振動特征吸收峰，而且此時氧原子的活性較強，因此，可以推斷Fe3O4納米粒子表面成功硅烷化。3406.85 cm-1是H-O的伸縮振動特征吸收峰，是一個較寬的吸附譜帶，是材料中的吸附水和游離水產生的。1625.98 cm-1是游離水中的H-O-H彎曲振動的吸收帶［17］。

2.2吸附實驗

2.2.1分子印跡聚合物和非分子印跡聚合物對土霉素的吸附比較圖4為Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物與非分子印跡聚合物對土霉素的吸附曲線。可見，Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物對土霉素的吸附作用明顯大于非分子印跡聚合物的吸附作用，說明Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物具有更為良好的選擇性吸附作用，且吸附量均是隨著初始濃度的增加而增大。

圖4　Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物和Fe3O4@SiO2@NIP非分子印跡聚合物對土霉素的吸附Fig.4　Absorption of Fe3O4@SiO2@MIP imprinted polymers and Fe3O4@SiO2@NIP non-molecularly imprinted polymers with OTC

2.2.2分子印跡聚合物對三種抗生素的靜態吸附與分析分子印跡聚合物對目標化合物的吸附，主要受兩種因素影響，即孔穴大小與目標化合物結構適應度、功能單體與目標化合物的匹配度。由圖5分析得知，Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物對土霉素和金霉素均具有良好的吸附性，因為使用強力霉素作為模板分子，盡管其與四環素分子量大小一致，但四環素分子結構中缺少了醇羥基，導致其與以強力霉素作為模板分子的印跡聚合物的識別位點、基團性質差異變大、匹配度降低，導致吸附特性降低，因此對四環素的吸附作用相對偏低。

圖5　Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物對四環素、金霉素和土霉素的靜態吸附Fig.5　Static absorption of Fe3O4@SiO2@MIP molecularly imprinted polymers with TC，CTC and OTC

一般用Scatchard分析考察Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物的吸附特性［18-19］。以吸附量對吸附量/平衡濃度作圖，得到Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物對土霉素吸附Scatchard分析圖（圖6）。從圖6可知，Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物平衡解離常數Kd在0.17～0.96 mg/mL之間，最大吸附量Qmax為56.28 mg/g，吸附能力略大于非分子印跡聚合物，而非分子印跡聚合物最大吸附量為41.55 mg/g。

圖6　Scatchard分析圖Fig.6　The Scatchard analysis of absorption

從圖6中可以看出，Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物的吸附曲線不呈直線關系，在圖的兩端有兩條線性關系的部分，說明在實驗濃度范圍內并不是完全等價的，而是有兩類不同性質的吸附結合位點，一類是親和力較強的結合位點，另一類是親和力較弱的結合位點。當吸附趨于平衡時，較弱的低結合位點與印跡分子相互發生協同作用，通過類似“誘導契合”的方法進行識別吸附［20］。當底物濃度較低時，高親結合位點作用明顯，其吸附貢獻大于低結合位點，低結合位點的吸附作用可忽略不計；當底物濃度較高時，高結合位點的吸附貢獻仍較大，但是低結合位點吸附的優勢顯現出來。而圖6b的Scatchard吸附分析曲線呈線性關系的，表明在研究范圍內，Fe3O4@ SiO2@NIP納米材料對目標物的的吸附作用是均一的、相同的，即隨著濃度的增加，吸附量對吸附量/平衡濃度也隨之增加，吸附貢獻主要來自于物理吸附，并非如Fe3O4@SiO2@MIP的兩種吸附共同作用的結果。

2.3方法評價

2.3.1標準曲線標準曲線實驗結果如表1所示。實驗表明，三種四環素類抗生素在此濃度范圍內線性關系良好（R2均大于0.999），方法靈敏度高。

表1　四環素類抗生素標樣的線性方程和相關性系數Table 1　Linear equations and correlation coefficients of tetracycline’s standard reagents

2.3.2檢出限方法的檢出限是按照上述確定的液相色譜檢測方法，配制濃度較低的標準溶液，觀察液相色譜的信噪比，并稀釋標準溶液，至信噪比為3∶1時，此時標準溶液的濃度即為該方法的檢出限。結果表明，該方法對四環素、土霉素、金霉素的檢出限分別為9.61、7.84、11.93 ng/mL。

2.3.3加標回收實驗圖7是鵝胸肉的加標樣品液相色譜圖，由圖7可知，三種四環素類抗生素在上述液相色譜實驗條件下，15 min之內可以結束分析，四環素與土霉素在前7 min之內即可出峰，金霉素在12 min出峰。也可看出Fe3O4@SiO2@NIP非分子印跡聚合物液相分析圖譜中雜峰較多，但是Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物雜峰較少，體現出了較高的特異性吸附。

圖7　加標樣品的液相色譜圖Fig.7　Liquid chromatograms of spiked samples

表2是在土霉素、四環素添加濃度分別為0.2、0.4、0.8 μg/mL，金霉素添加濃度為0.4、0.8、1.6 μg/mL的情況下測定的加標回收率實驗結果。由表2中可以看出，納米Fe3O4@SiO2@NIP非分子印跡聚合物對肉制品中土霉素、四環素、金霉素藥物的平均加標回收率分別為34.63%、32.90%、32.38%；Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物對肉制品中土霉素、四環素、金霉素藥物的加標回收率分別為100.08%、93.71%、100.88%，可見，Fe3O4@SiO2@MIP印跡聚合物為吸附劑時回收率略有增大。變異系數在1.54%～7.44%之間，表明設計的殘留檢測方法可靠，精密度和準確度均可以達到四環素類抗生素殘留分析的要求。

依據所建立的實驗方案檢測鵝胸肉、鵝腿肉、鴨胸肉、鴨腿肉、鯽魚肉以及牛奶樣品中3種四環素類抗生素的殘留。檢測結果如表3所示，6種樣品中四環素類抗生素殘留量均低于最大殘留量100 ng/g的國家標準要求。

表2　在鵝胸肉中加標回收率實驗分析Table 2　Analysis of spiked recovery in geese（n=5）

表3　不同樣品中四環素類抗生素檢測結果Table 3　The result of detection of tetracycline antibiotics in different samples

2.3.4精密度取1 μg/mL的3種四環素類抗生素的標準混合溶液，在上述色譜條件下，重復進樣5次，對先后5次進樣所得相應組分峰面積進行差異性比較，結果見表4。相對標準偏差RSD（%）在2.60%以內，表明該方法的重現性較好。

表4　3種四環素類抗生素的精密性實驗Table 4　The precision of three tetracycline antibiotics

3　結論

針對四環素類抗生素在復雜樣品中吸附特異性偏低和檢測時間較長等問題，利用表面分子印跡技術，合成磁性分子印跡復合物，結合固相萃取-高效液相色譜技術，可實現15 min之內同時檢測樣品中多種抗生素殘留。Fe3O4@SiO2@MIP分子印跡聚合物的最大吸附量Qmax為56.28 mg/g，對樣品中土霉素、四環素、金霉素藥物的平均加標回收率分別達到了100.08%、93.71%、100.88%，變異系數在1.54%～7.44%之間，精密性實驗的相對標準偏差在2.60%以內，實驗方法準確可靠、重現性良好。大量實驗也表明，使用分子印跡技術提高了對目標分子的吸附選擇性，為食品中四環素類抗生素污染的監控和治理提供了更完善的快速富集手段。該方法也可推廣到其他復雜樣品中農獸藥的殘留分析。

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Magnetic molecularly imprinted nanocompsites combined with solid phase extraction detect tetracycline antibiotic residues

WANG Ya-qun，PAN Dao-dong*
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

In this study，Fe3O4@SiO2@MIP core-shell nanocomposite was synthesized by surface molecular imprinting technique.It had an ability of selective extraction and detection of tetracycline antibiotics.The magnetic solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography（MSPE-HPLC）detects three kinds of antibiotic residues simultaneously.The magnetic Fe3O4@SiO2@MIP core-shell nanocomposites was characterized by scanning electron microscopy（SEM），transmission electron microscopy（TEM）and Fourier transform infrared（FT-IR）analysis.The result showed that the limit of detection of tetracycline，oxytetracycline and chlortetracycline was 9.61，7.84 and 11.93 μg/kg，respectively；the maximum adsorption capacity of magnetic Fe3O4@SiO2@MIP molecularly imprinted polymers was obtained at 56.28 mg/g，its recoveries ranging from 93.71%to 100.88%were obtained with relative standard deviations in the range of 1.54%～7.44%. Compared with Fe3O4@SiO2@NIP，the selective adsorption of Fe3O4@SiO2@MIP was more capable.

tetracycline antibiotic；Fe3O4nanocomposites；MIP；SPE；HPLC

TS207.5

A

1002-0306（2015）18-0053-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.002

2015－01－04

王雅群（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品非法添加物的快速檢測，E-mail：443856486@qq.com。

潘道東（1964-），男，博士，教授，研究方向：畜產品加工與質量安全，E-mail：daodongpan@163.com。

國家支撐計劃（2012BAK08B01-2）；浙江省公益性項目（2014C32051）。